摘要：目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni+鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。

摘要：目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A（PE），为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因，将其克隆于原核表达载体pQE-31中，所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109，IPTG诱导表达；制备融合蛋白包涵体，并采用Ni—NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白；采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性，MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化，扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致；转化*** JM109后，IFTG诱导目的蛋白表达率约为25％；SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约为66×10^3，与理论预期值一致；破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95％。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度（IC50值）分别为2．13μg/ml、2．58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化，获得了具有细胞毒活性的重组PE，为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。

摘要：设计2对针对恶性疟原虫（P．f.）小亚单位核糖体核糖核酸基因（SSUrDNA）的特异引物，采用双温度点套式聚合酶链式反应（PCR）技术，从用煮沸法快速萃取的样本DNA中，扩增***片段，进行恶性疟原虫的检测。结果表明，该系统扩增样本DNA片段大小恒定，经限制性酶切进一步分析，证实均为***目的片段，其检测原虫的灵敏度为0．8×10-6，较常规镜检敏感，并具有鉴别红内期早期阶段疟原虫种类和确认有无混合感染的潜力。因而认为该系统是灵敏、准确、简易、快速的疟疾诊断新方法，值得推广使用。

摘要：目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达、纯化,为进一步利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础。方法运用Bioedit和DNAStar软件对MRSA耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段序列和活性区结构特点及其活性发挥进行分析,设计TG-TPase嵌合药靶,并通过引物设计从MRSA菌株中克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP基因片段,进一步用引物延伸法、酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因并亚克隆至原核表达质粒pET30b中,转化Rosetta(DE3)plysS大肠埃希菌,用IPTG进行诱导表达,并小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化和Western blotting鉴定。结果设计的TG-TPase嵌合药靶包括PBP2分子的TGase活性区、绞链区的N-端,PBP2a分子绞链区C-端及完整的TPase结构域,融合基因为1 935 bp,编码645个氨基酸,等电点为7.10,相对分子质量72 000。用PCR法从MRSA菌株中成功克隆了青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达出药靶蛋白,表达结果与预期设计相符合。融合蛋白纯化分析表明,融合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上。结论成功设计、构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,并对融合蛋白进行了初步纯化,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。

摘要：目的　研究抗HIV感染者淋巴细胞HIV 1辅受体突变的情况 ,阐明其感染抑制的分子机理。方法　设计特定的引物 ,用PCR方法检测健康人、HIV感染者和抗HIV感染者的基因组DNA中HIV辅受体 (CCR5 )是否突变。结果　抗HIV感染者发生CCR5△ 32纯合子突变 ,健康人及HIV感染者CCR5基因未发生突变。讨论　发现了我国本土人群存在CCR5△ 32纯合子突变 ,此突变可能为抗HIV感染保护机制 。

摘要：目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,构建其真核表达质粒,为嵌合基因的高效、分泌型表达奠定基础。方法在序列结构分析的基础上,设计引物从MRSA菌株中扩增其耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段,进一步用酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因,亚克隆至酵母表达质粒pPIC9K中,转化DH5α大肠埃希菌。经酶切、PCR和核苷酸测序鉴定正确的重组质粒用SalⅠ线性化,整合入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,在DNA和基因转录水平鉴定出阳性重组酵母。结果采用PCR从MRSA基因组中扩增得到了873bp的TGase片段和1044bp的TPase片段。以酶切连接构建的TG-TPase嵌合基因经酶切、PCR鉴定,能获得约1900bp的融合片段,与预期结果相符,测序表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转化GS115后,得到5个高拷贝阳性转化子,经诱导表达和PCR鉴定,这些转化子能转录出目的基因的mRNA。结论成功构建了含TG-TPase嵌合基因的重组毕赤酵母工程菌,为进一步高效制备嵌合蛋白、进而利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选创造前提。

摘要：设计二套特异引物,用双温度点套式PCR方法,以煮沸法快速萃取样本DNA为模板,选择性扩增SSUrDNA特定片段用于人体间日疟原虫(P.v.)的检测和鉴定.实验表明,该系统检测P.v.的灵敏度至少可达1.08×10^(-6)(约10个原虫/μL全血);检测经镜检证实的30份采自我国五省疟区间日疟患者冻存血样、10份原虫率约为10^(-4)或厚血片可见原虫而薄血片未见原虫的低原虫率血样及10份、1984年采集在4℃干燥保存至今的间日疟患者滤纸血样,除一份滤纸血样扩增阴性外,其余均在同一大小位置(约516bp)产生特定的扩增片段;而20份非疟区采集的健康供血员血样、4株培养红内期恶性疟原虫(P.f)、1株人源弓形虫(T.g)、1株人源Leishman原虫(L.d)及空白对照均无此扩增带出现.此外,鉴定30份采自云南疟区、镜检确认为恶性疟患者血样及3份采自海南的非典型形态疟原虫感染血样,其中17份产生明显的P.v特定扩增带型,占样本数的51.5％.利用该系统检测及鉴定P.v,从样本处理到结果观察共约需4h.上述结果表明,该系统具备灵敏、准确,操作较为简便、快速,结果易于判定等优点,同时还具有鉴别虫种、确认有无混合感染的潜力.

摘要：目的　寻找 JEV m Ab 2 F2识别的抗原表位 ,为 JEV小分子多肽疫苗合理设计提供依据 .方法　链亲和素包被塑料平皿 ,加入生物素标记 2 F2与噬菌体随机 15肽库 ,再洗脱 ,扩大培养进行三轮淘筛 ,经夹心 EL ISA、竞争 EL ISA鉴定后 ,挑取 10个阳性克隆 ,DNA测序 ,与 JEV E蛋白同源分析 .结果　筛选到的噬菌体能特异地与 2 F2结合 ,并且这种结合可被天然抗原所抑制 . 10个克隆的氨基酸序列相同 :-HTPQWSPSQYRPSL R- ,同源分析在 JEV E蛋白 2 2 4～ 2 2 9aa得到一个同源性较高的序列 :PXXSPS.结论　 PXXSPS可能为 JEV E蛋白的一个模拟表位 .

摘要：目的 :研究RNAi(RNAinterference)效应对HCVns5b基因表达的抑制作用 .方法 :根据HCVns5b基因序列及其二级结构特征 ,依据Tuschl等设计siRNA的原则 ,确定并合成了针对ns5b基因的siRNAs;利用电转化方法将合成的siRNAs转染NS5B EGFPHepG2细胞株 ,以未转染的细胞为对照 ;细胞爬片后经DAPI染色 ,荧光显微镜下观察和半定量RT PCR法检测siRNAs的抑制效应 .结果 :化学合成的siRNAs可以抑制HCVns5b基因的表达 ,效率可达 70 %-80 %以上 .结论 :在细胞水平上 ,化学合成的siRNAs可以抑制HCVns5b基因的表达 。

摘要：目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体；建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物，从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA，RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段，BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3，1（-），转化菌株JM109感受态细胞，获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3，经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞，经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系，用RT-PCR，IFA，Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3；建立了稳定转染的HepG2细胞克隆，命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．