摘要：目的体外合成针对人环氧化酶-2(hCOX-2)的小分子干扰RNA(siRNA),并转染入人滑膜成纤维细胞,通过比较不同siRNA抑制COX-2 mRNA表达、COX-2蛋白合成以及下游产物PGE2水平,旨在确定特异性阻断人滑膜成纤维细胞COX-2的siRNA。方法分离、培养和传代人类风湿关节炎(类风关)滑膜成纤维细胞。设计合成4条针对hCOX-2 mRNA siRNA(1#-4#siRNA),1条随机序列siRNA。设立1#-4#siRNA和随机序列siRNA组(NC)及未转染对照组(CTL组)。应用Lipofect AMINE2000将上述siRNA分别转染人滑膜成纤维细胞,4h后各培养孔加入终浓度为100nmol/L的佛波酯。转染36h、48h后,各组提取蛋白质和总RNA,应用RT-PCR检测hCOX-2 mRNA表达水平,通过Western Blot检测hCOX-2蛋白表达水平。采用ELISA方法检测各组上清液PGE2的水平。结果转染36h,PCR结果显示,CTL、NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRNA、阳性对照HeLa细胞组hCOX-2 mRNA电泳条带密度值分别为1、0.72、0.3、0.25、0.4、0.04、2.1。WesternBlot结果提示上述各组hCOX-2蛋白密度值分别为1、1.04、0.52、0.39、0.9、0和2.48。转染48h后,各组hCOX-2蛋白条带密度值分别为0.05、0.52、0.51、0.9和0.15。转染24h、48h和72h后,4#siRNA组培养上清液PGE2的水平较其他各组低。结论4#siRNA能有效抑制人滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达和COX-2蛋白的合成,且上清液中PGE2水平最低,证实4#siRNA能特异性阻断COX-2在滑膜成纤维细胞表达。

摘要：survivin基因是近年来发现的在大多数肿瘤组织中高表达的基因，具有调控细胞周期和细胞凋亡的双重作用，与肿瘤的发生密切相关，抑制其功能将有助于肿瘤的治疗。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是利用双链RNA在转录后水平特异性地抑制基因表达的一项技术，是研究基因功能和基因治疗的有力工具。本研究应用RNAi技术，将自行设计和构建包含有针对survivin基因的特异性小分子干扰RNA（siRNA）的重组质粒转染入子宫内膜癌细胞，以观察阻断survivin基因表达对细胞增殖和细胞周期的影响。

摘要：目的本文以逆转录病毒作为载体将sflt-1基因结构中前3个免疫球蛋白区域的编码序列插入 ,构建成含有sflt-1的载体 ,为抑制肿瘤的血管新生提供基础。方法与结果1、sflt-1基因制备购买新鲜胎盘 ,用异硫氰酸胍提取总RNA。经RT -PCR制备sflt-1基因 ,引物设计如下 :P1 :5’ -GGAATTCCGCGCTCAC CATGGTCAGC -3’ ;P2 :5’ -TTGGATCCTACCGCTTGCCAGCTACG GTTT-3’。目的基因共1080bp,包含sflt-1前三个免疫球蛋白区域 ,两端分别加上EcoRI和BamHI位点。PCR反应设定 :94℃5min,使模板充分变性 ,94℃1min ,55℃1min ,72℃1min30s ,共30个循环 ,72℃10min。PCR产物有目的片断和600bp的杂带 ,经调整复性温度不能去除 ,将含目的片断的凝胶条带切下并提取DNA。2、sflt—1基因片断的克隆与测序用 pUC -T-vector将目标DNA接入质粒 ,DNA片断A -tailing:2μl10Xbuffer,1UTaq酶 ,0 .5μl10mMdNTP ,纯化的DNA片断 ,共组成201反应体系。72℃15min。纯化DNA连接反应 ,1μlpUC_mT ,1μl2Xbuffer,1150 %PEG8000 ,纯化的DNA产物70g,0 .5μlT4DNA连接酶 ,加适量水组成10μl反应体系 ,20℃温育8h ,22℃温育8h ,连接反应产物转化感受态细菌 ,置于含50g/m1青霉素的LB平板 ,37℃过夜 ,挑取克隆在LB中扩增 ,提取质粒后用EcoRI和BamHI酶 切 ,

摘要：背景:已有研究证实,周围神经损伤后大脑皮质会出现功能可塑性变化;神经生长相关蛋白43在发育中神经系统的表达特征提示,它与神经发育中突起延伸和突触形成有关,参与突触重建过程。目的:实时定量RT-PCR方法检测实验动物健侧颈7神经根移位前后,不同阶段相应大脑皮质组织神经生长相关蛋白mRNA的相对表达量及动态变化,探讨周围神经修复与中枢神经可塑性的关系。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-09/2008-12在上海市周围神经重点实验室和复旦大学实验动物科学部完成。材料:成年SD大鼠108只,分为臂丛损伤未修复组(n=48)、臂丛损伤修复组(n=48)及对照组(n=12)。方法:大鼠左侧为实验侧,臂丛损伤未修复组在大鼠左侧取锁骨下横形切口,找到臂丛各神经根并造成全臂丛根性撕脱伤。臂丛损伤修复组同法将大鼠全臂丛神经根性撕脱后,取右侧锁骨下切口,显露健侧颈C7神经根备用;取左侧前臂尺神经通过皮下隧道桥接健侧颈7神经根与正中神经端端吻合。对照组为成年雌性正常大鼠,不进行任何处理。主要观察指标:于术后1d,3d,1周,2周,1个月,3个月,6个月,10个月共8个时段及对照组取材,采用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR法检测健侧颈7神经根移位术前后对侧(右侧)大脑前肢投射区域皮质组织生长相关蛋白43mRNA相对表达量及动态变化。结果:臂丛损伤未修复组对侧(右侧)大脑前肢投射区域皮质组织生长相关蛋白43mRNA的相对表达量变化规律为术后第1天开始升高,第3天达到高峰,然后逐渐降低。术后1d,3d和1周与对照组比较差异具有显著性意义(P<0.05,P<0.01)。臂丛损伤修复组对侧(右侧)大脑前肢投射区域皮质组织生长相关蛋白43mRNA的相对表达量变化规律为术后第1天开始升高,第3天达到高峰,然后逐渐降低,至术后3个月再次升高,6个月达到高峰,然后逐渐降低。术后1d,3d,1周和6个月与对照组比较差异具有显著性意义(P<0.05,P<0.01)。结论:臂丛损伤健侧颈7移位术前后相应大脑皮质生长相关蛋白表达变化与临床现象一致,提示生长相关蛋白在大脑皮质及突触可塑性方面发挥作用。

摘要：PBL病案的优劣直接影响了PBL小组讨论的进展顺利与否以及讨论的效率高低,因此上海医学院对PBL病案的进一步规范化设计以及质量监控开展了初步研究。结果显示学生对病案的总体满意度较高,但在对激发学生兴趣、生动性、提供足够的深度和广度供学生思考和讨论以及培养临床思维等方面尚存在一定差距。因此需对病案设计的层次性、趣味性和挑战性方面进行进一步提高,规范病案设计,持续进行质量监控。

摘要：目的鉴定微血管内皮细胞上是否表达生成硫化氢(H2S)的酶,为深入研究硫化氢的心血管作用提供新线索。方法原代培养大鼠心脏微血管内皮细胞(CMEC),设计相应引物后用RT-PCR的方法检测胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)基因转录情况,进一步用兔抗大鼠CSE和CBS多克隆抗体对CMEC进行蛋白水平的免疫荧光染色。此外对另两种微血管内皮细胞株RF/6A和bEnd.3也检测了H2S生成酶的表达。结果三种微血管内皮细胞都扩增出CSE基因的特异条带,而CBS基因都未扩增出相应产物。CMEC的免疫荧光染色显示CSE抗体染色为阳性,CBS抗体染色为阴性。结论首次发现了微血管内皮细胞上存在CSE的表达,提示内皮细胞可以通过生成硫化氢调节心血管活动。

摘要：目的RNA干扰是由双链RNA引发的转录后基因沉默。为了研究表皮生长因子受体对食管癌细胞的作用,文中构建针对人HER4基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染人食管癌细胞Eca-109,观察其基因沉默效果,探索食管癌基因治疗的新途径。方法根据siRNA设计原则,设计针对HER4基因的两条寡核苷酸链,退火后与载体***+gfp连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染食管癌细胞Eca-109,用荧光定量PCR和Western blot方法检测HER4蛋白表达情况。结果经酶切鉴定和DNA测序分析后,提示HER4靶向RNA干扰重组载体构建成功。转染食管癌细胞后,用荧光定量PCR和Western blot法检测HER4基因表达水平显著降低。结论成功地构建了针对人HER4基因的siRNA表达载体,并可有效抑制食管癌细胞Eca-109中该基因的表达。

摘要：目的体外合成和筛选特异性阻断人滑膜成纤维细胞(RASF)环氧合酶-2(hCOX-2)的小分子干扰RNA(siRNA),同时了解COX-2抑制对炎症因子表达水平的影响。方法设计4条针对人COX-2 mRNA siRNA(1#～4#siRNA),1条随机序列作为对照。分成A～H组,A组为空白阴性对照,B～F组处理依次为随机siRNA、1#～4#siRNA。应用LipofectAMINE 2000将上述siRNA转染入RASF,各培养孔加入100 nmol/L的佛波酯。转染48h后,分别应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western Blot检测hCOX-2 mRNA和蛋白表达水平。采用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测各组上清液中前列腺素E_2(PGE_2)和白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、血管内皮生长因子(VEGF)水平。结果4#siRNA转染的RASF表达hCOX-2 mRNA和蛋白水平明显低于其他siRNA干预组和阴性对照,且其上清液PGE_2和IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF水平较其他各组明显下降。结论4#siRNA能有效抑制COX-2 mRNA表达和COX-2蛋白的合成,且上清液中PGE_2和IL-1β、IL-6、TNF-α及VEGF水平最低。