摘要：以广西巴马小型猪活化的外周血淋巴细胞为材料,抽提总RNA,反转录成cDNA.参照人FasL基因保守序列设计引物,扩增得到包括全长阅读框序列的特异性DNA片段.将其克隆于T vector,以双脱氧法完成测序.在国际上首次完成中国小型猪FasL基因序列(GenBank登录号:AY033634).该序列全长846bp,编码282个氨基酸的CD95L分子,为Ⅱ型膜蛋白,其膜内部分富含脯氨酸残基.通过比较分析发现,小型猪与人FasL基因的核苷酸序列同源性为87%,氨基酸序列同源性为88%,比人的FasL基因多一个氨基酸.这些数据将为进一步用小型猪作为实验动物进行生物学和免疫应答研究提供必要的资料.

摘要：以完整EST为参考序列设计引物,以人的胎脑cDNA为模板,用PCR方法筛选获得Rab26基因全长序列,并亚克隆到载体pGEM-T,真核表达载体pEGFP-N1和原核表达载体pET-32a(+)中.RT-PCR显示该基因在不同组织的肿瘤细胞株中表达量有明显的差异.把Rab26基因转染入HeLa细胞中,通过与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合表达,显示Rab26定位于胞内膜性细胞器上.在大肠杆菌表达系统获得Rab26基因的高表达.这些结果为进一步研究Rab26基因在细胞内吞和运输功能等方面打下了基础.

摘要：21世纪初,工程科学的研究理念与现代生物学、系统科学以及合成科学的融合,形成了以采用标准化表征的生物元件,在理性设计指导下,重组乃至从头合成创新的、具有特定功能的人造生命为目标的"合成生物学"。合成生物学开启了生命科学可定量、可计算、可预测、可制造的"会聚"研究新时代。

摘要：目的研究siRNA诱导的日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)基因转录本和蛋白水平的RNA干扰(RNAi)效应。方法设计并合成2条针对SjAR基因的siRNA(siRNA-1和siRNA-2)和1条阴性对照siRNA(siRNA-NC)。用日本血吸虫尾蚴感染4~6周龄雌性昆明鼠(800~1 000条/鼠),13 d后灌注小鼠肝门静脉收集童虫,每(120±10)条童虫为一组,分别采用电转法和浸泡法对各组童虫进行RNAi处理。电转处理法:向电击杯中分别加入5μg siRNA-1、siRNA-2、siRNA-NC或等体积的焦碳酸二乙酯(DEPC)水(空白对照),经125 V 20 ms方波脉冲电击童虫1次后,继续培养48 h;浸泡处理法:向童虫培养基中加入siRNA-1、siRNA-2或siRNA-NC溶液至siRNA浓度为200 nmol/L,第3天时更换一半新鲜培养基并补充siRNA,共培养5 d。每处理设3个平行对照组。干扰结束后,采用TRIzol法提取虫体RNA和可溶性总蛋白,将RNA反转录为cDNA,以SjGAPDH基因为内参,实时定量PCR检测SjAR转录本相对表达水平的变化,Western blotting分析SjAR蛋白水平的变化。结果实时定量PCR结果显示,采用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC电转后,虫体SjAR转录本水平分别为(90.6±16.2)%、(84.2±7.3)%和(105.9±10.3)%,与空白对照组[(100.9±16.8)%]的差异均无统计学意义(P>0.05);使用siRNA-1、siRNA-2浸泡后,SjAR转录本水平为(48.6±8.2)%和(73.4±4.7)%,均较空白对照组[(100.0±3.3%)]显著下降(P0.05)。Western blotting分析和条带定量结果显示,以空白对照组为标准,使用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC浸泡后,SjAR蛋白水平分别为79.0%、97.8%和103.2%。结论使用浸泡法对日本血吸虫童虫SjAR进行RNAi处理可降低靶基因转录本和蛋白的表达水平。

摘要：引物与模板的结合特异性是PCR反应成功与否的主要决定因素之一.在进行以16srDNA为目标序列的菌种鉴定或者各种检测应用中,对引物的特异性具有较普遍的要求.需扩增出完整的目标属,实现属内保守,同时避免有效扩增其他属的相应序列即实现属间特异.对此,我们对引物设计进行优化,通过分析所有已知细菌16srDNA序列,针对特定目标属筛选特异和最高效的引物对,并在淞江鲈的体表菌群样品中进行验证实验.结果表明,所设计的引物具有较好的属内保守性和特异性,而且引物在扩增中的效率也有一定的保证,能够很好地应用于菌群的定量PCR分析.

摘要：目的克隆表达日本血吸虫钙蛋白酶(Sjcalpain),了解Sjcalpain在尾蚴内的分布及其在尾蚴侵染中的作用。方法根据SjCalpain基因全序列(GenBank登录号为AB016726)设计引物,PCR分别扩增Sjcalpain的催化位点区域和Ca2+结合位点区域的基因片段,克隆入pET-28a原核表达载体,并在大肠埃希菌(***)BL21(DE3)中进行原核表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达和纯化情况。纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体,ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测多克隆抗体的效价和特异性。利用免疫荧光定位技术观察Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况。将尾蚴和钙蛋白酶抑制剂孵育后感染小鼠,计算血吸虫减虫率。结果成功构建了Sjcalpain的催化位点/pET-28a和Ca2+结合位点/pET-28a原核表达重组质粒,在*** BL21(DE3)中成功表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为43 000和39 000,与预期大小一致,且均为包涵体表达。组氨酸标签亲和层析成功纯化得到目的重组蛋白。间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价超过1∶80 000。免疫定位结果显示,Sjcalpain在日本血吸虫尾蚴头部分布较多。尾蚴侵染抑制实验中,钙蛋白酶抑制剂作用组平均获虫19条,对照组平均获虫23条,减虫率为17.4%。结论 Sjcalpain蛋白产物主要分布在日本血吸虫尾蚴的头部;Sjcalpain被抑制后可以减少入侵宿主的尾蚴数量,说明Sjcalpain在尾蚴感染宿主皮肤过程中发挥一定的作用。

摘要：目的结合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术及侧流层析试纸条法(LFD)建立日本血吸虫特异核酸片段的快速可视化检测方法,并初步评价其检测日本血吸虫感染小鼠血清中血吸虫循环核酸的应用价值。方法以日本血吸虫非长末端重复序列逆转录转座子SjCHGCS19为靶标,设计RPA引物和探针,以日本血吸虫基因组DNA为模板进行RPA及LFD检测,并优化RPA反应温度及时间,建立日本血吸虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法。用RPA-LFD检测模板量为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7ng的日本血吸虫基因组DNA,评价其敏感性;用RPA-LFD方法检测日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫基因组DNA,评价其特异性。制备含0.01、0.1、1、10和100 ng日本血吸虫成虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清。用40条日本血吸虫尾蚴感染小鼠,采集并分离感染前及感染后7、21、35 d小鼠尾静脉血清。提取模拟阳性鼠血清、感染小鼠血清样品中的循环DNA,评价RPA-LFD检测血清中血吸虫特异核酸的可行性及其早期检测价值。结果建立了快速可视化检测SjCHGCS19重复序列的RPA-LFD方法,30~45℃反应10 min即可检出目的片段。RPA最优反应条件为39℃,20 min。RPA-LFD对日本血吸虫成虫基因组DNA的最低检出限为10^-6ng(1 fg)。特异性评价结果显示,RPA-LFD检测曼氏血吸虫和埃及血吸虫基因组DNA结果为阳性,检测卫氏并殖吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果为阴性。RPA-LFD方法可成功检出含0.01~100 ng日本血吸虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清以及血吸虫感染后7、21、35 d鼠血清中的游离SjCHGCS19 DNA片段。结论建立了一种快速、可视化检测日本血吸虫循环核酸的RPA-LFD方法,该方法敏感性高,具有检测血吸虫早期感染的潜在应用价值。

摘要：目的克隆、表达日本血吸虫2种酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的全长基因．并研究这2种基因在日本血吸虫不同性别和不同发育阶段的转录特异性。方法设计特异性引物，从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出SjTYR1和SjTYR2的全长片段，并克隆人原核表达载体pSJ2，验证正确的重组质粒转化大肠埃希菌（***）Rosetta Gami细胞，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并用组氨酸标签对表达产物进行亲和层析纯化。将纯化后获得的重组蛋白SjTYR1和SjTYR2分别免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。分别以重组蛋白免疫兔血清和日本血吸虫感染兔血清为一抗，用蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性和免疫反应性；以重组蛋白免疫兔血清为一抗．用Westernblotting观察其与日本血吸虫虫体蛋白的反应情况。制备感染后14、16、18、20、22、24、26和28d雌虫和雄虫的总RNA，利用RT-PCR分析SjTYR1和SjTYR2基因在日本血吸虫不同性别及不同发育时间的转录水平的差异。结果构建了重组原核表达载体SjTYR11/pSJ2和SjTYR2／pSJ2，诱导后获得包涵体形式表达的重组蛋白，相对分子质量（尬）分别为55000和56800，与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白SjTYR1可被日本血吸虫感染兔血清识别，而SjTYR2则不能。rSjTYR1免疫兔血清与虫体蛋白反应后，可见一条约M100000的条带，rSjTYR2免疫兔血清不与虫体蛋白反应。在雄虫体内，2种酪氨酸酶均不转录；在雌虫体内，2种酪氨酸酶在感染后24d内不转录，自24d开始出现激增，之后逐渐提高，感染后28d达到相对最大值。结论构建了SjTYR1和SjTYR2的重组质粒并表达，2种重组蛋白均具有免疫原性和免疫反应性。SjTYR1和SjTYR2在血吸虫雌虫中特异表达，且在感染终宿主后24-28d转录水平升高。

摘要：目的联合重组酶聚合酶扩增及电化学DNA传感器检测技术,建立一种敏感、特异且简单的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核酸检测方法。方法提取日本血吸虫基因组DNA,以Sj R2基因片段为靶序列,设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物与探针,与电化学DNA传感器(EC)检测技术联合,将探针固定于多通道电极芯片进行界面RPA扩增及电化学检测,建立日本血吸虫核酸等温检测方法。优化RPA反应条件,通过检测10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8ng日本血吸虫基因组DNA,评价RPA-EC方法的敏感性;通过检测10 ng日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫及华支睾吸虫的基因组DNA,评价RPA-EC方法的特异性。取10只6~8周龄C57成年小鼠,每鼠经腹部贴片感染40条日本血吸虫尾蚴,分别于感染前(0 d)和感染后7、21、35 d收集尾静脉血清,验证RPA-EC方法检测感染动物动态血清DNA中Sj R2基因片段的可行性。结果RPA-EC联合检测方法可在37℃、30 min内完成SjR2基因片段的界面快速扩增及检测,成虫基因组DNA的最低检出限可达10^-8ng,与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫及华支睾吸虫基因组DNA无交叉反应,具有较好的特异性。日本血吸虫感染小鼠实验结果显示,RPA-EC联合检测方法可高敏感检出感染后7、21、35 d等不同感染期小鼠血清中的SjR2基因片段。结论本研究所建立的RPA-EC联合检测方法敏感性高、特异性好、操作简便,具有一定的应用前景。

摘要：目的基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术和簇状规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a)技术,建立日本血吸虫特异性核酸片段的快速可视化检测方法,并初步评价其应用价值。方法以SjCHGCS20(GenBank:FN356222.1)为靶标序列,设计RPA引物、单链DNA(ssDNA)报告探针和CRISPR RNA(crRNA)序列,优化RPA反应体系中T4重组酶Y、T4重组酶X、T4单链结合蛋白和肌酸激酶的浓度以及RPA反应的温度和时间。建立RPA-CRISPR/Cas12a一管式方法:将优化的RPA反应体系、矿物油和Cas12a切割反应体系放入反应管中,采用优化的反应条件进行RPA扩增后,混合RPA反应产物和Cas12a切割反应体系,Cas12a切割反应后在蓝光割胶仪照射下观察结果,能观察到明亮的绿色荧光则反应产物呈阳性。以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6ng的日本血吸虫成虫基因组DNA为模板进行RPA-CRISPR/Cas12a检测,评价该方法的敏感性;以1 ng日本血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫的基因组DNA为模板进行RPA-CRISPR/Cas12a检测,评价该方法的特异性。取日本血吸虫DNA终浓度为0.2、2、20、200 ng/ml的模拟阳性血清和感染日本血吸虫后第3、7、14、21、28、35和42天小鼠的血清,提取DNA后进行RPA-CRISPR/Cas12a检测,评价该方法的检测效果。结果优化的RPA反应体系中,T4重组酶Y、T4重组酶X、T4单链结合蛋白和肌酸激酶的终浓度分别为50、440、200和120 ng/μl;优化的RPA反应条件为40℃30 min。建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法敏感性评价结果显示,当日本血吸虫成虫基因组DNA含量≥10-5ng时反应产物呈阳性;特异性评价结果显示,仅以日本血吸虫成虫基因组DNA为模板的反应产物呈阳性,以曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫基因组DNA为模板的反应产物均呈阴性。日本血吸虫DNA终浓度为2、20、200 ng/ml的模拟阳性血清反应产物呈阳性,终浓度为0.2 ng/ml的模拟阳性血清反应产物呈弱阳性。血吸虫感染后第28和42天的小鼠血清反应产物呈阳性、第35天的呈弱阳性。结论本研究建立了检测SjCHGCS20序列的RPA-CRISPR/Cas12a一管式方法,最低检出限为10-5ng DNA,且与卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、曼氏血吸虫等基因组DNA均无交叉反应,操作简单、反应迅速、特异性高、可借助蓝光激发裸眼观察结果,具有较好的现场检测潜力。