摘要：以实验室筛选的UD8豆豉芽孢杆菌的总DNA为模板,应用PCR技术根据豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2)设计并合成1对引物,扩增出了豆豉纤溶酶基因,将该基因克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒EC-BS8上,构建成表达质粒EC-BS8,再将其转化到枯草芽孢杆菌Bs6中。筛选表达菌株,实现了豆豉纤溶酶基因在枯草杆菌中高效表达。获得重组菌纤溶酶活力高达9 830 ***-1,是出发菌株活力的2.9倍。经纯化SDS-PAGE鉴定重组豆豉纤溶酶相对分子质量为31.0 kDa。

摘要：AgrA作为金黄色葡萄球菌双组分信号转导系统(two-component signal transduction system,TCST)的反应调节因子,能调控细菌毒力因子的表达,在金黄色葡萄球菌致病过程中起着重要的作用。采用无限制克隆法构建AgrA表达载体,在AgrA蛋白的C端融合绿色荧光蛋白(GFP)标签,通过实时监测GFP的荧光强度来快速检测重组蛋白的表达水平。首先利用单因素实验,筛选出宿主菌株BL21-(DE3)-PlysS;其次,结合Box-Behnken试验设计,筛选出最优蛋白质表达条件:诱导时间为22h、转速为222r/min、诱导剂浓度为0.5mmol/L,AgrA产量达到5.56mg/L。最后,基于AgrA蛋白LytTR区域的非放射性凝胶阻滞实验(non-radioactive electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证了AgrA的生物活性。提出了反应调节蛋白AgrA在大肠杆菌高效可溶性表达的策略,为双组分信号转导系统的体外研究奠定基础,也为其他反应调节蛋白的可溶性表达与分离纯化提供了一个可行借鉴。