摘要：目的应用基因芯片技术进行北方汉族人群HLAⅠ、Ⅱ类抗原中分辨度分型研究，建立稳定的HLA检测芯片。方法采用寡核苷酸芯片分型方法，选择了中国人群基因频率较高的等位基因，同时考虑遗传的连锁不平衡，根据HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB、HLA-DQA不同基因亚型的独特序列，完成了探针的设计与筛选，共设计了213条探针（HLA-A56条，HLA-B66条，HLA-DQA22条，HLA-DQB38条，HLA-DR31条）制成基因分型芯片。采用带荧光标记的引物，用合适的PCR方法扩增HLAⅠ、Ⅱ类抗原上的多态性区域，产物与芯片上探针杂交。杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断，以此确定样品基因型。结果所有样本的HLAⅠ、Ⅱ类抗原基因分型均获成功。此中分辨度探针可分出598个Ⅰ类抗原等位基因，511个Ⅰ类抗原等位基因，可捡出Ⅰ类抗原特异性57个，Ⅱ类抗原特异性30个。结论基因芯片用于HLAⅠ、Ⅱ类抗原分型可行。其分辨率高、特异性强，可用于HLA基因分型、骨髓移植、器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗传性疾病的人群筛查。

摘要：目的 构建S6K1 shRNA基因重组腺病毒（S6K1Ax）并在细胞及小鼠肝脏验证对S6K1基因的沉默效果.方法 设计3种S6K1 shRNA序列,通过在pcPUR质粒与pcDNA3.1质粒、cosmid质粒之间的拼接将S6K1 shRNA转染进腺病毒,筛选沉默效果最佳的S6K1Ax并在293细胞扩增纯化得到高效价的S6K1Ax.感染来源于小鼠的肝脏、肌肉、脂肪细胞系,在Western blot水平评价其对S6K1蛋白表达的抑制效果.将S6K1Ax注射进C57BL/6J小鼠尾静脉,6 d后处死小鼠取肝脏,逆转录-聚合酶链反应和Western blot观察小鼠肝脏S6K1在mRNA和蛋白水平的表达.检测注射S6K1Ax前后小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）变化.结果 Western blot证实制备的S6K1 Ax可抑制来源于小鼠的肝脏、肌肉、脂肪3种细胞系和小鼠C57BL/6J肝脏S6K1的蛋白表达.小鼠肝脏S6K1 mRNA结果显示：对照组为1.39±0.21,实验组为0.63±0.09,t=6.132,P〈0.01,差异有统计学意义.S6K1Ax注射小鼠,ALT水平注射前为（15.15±4.43）U/L,注射后为（17.32±4.22）U/L,t=1.451,P〉0.05,差异没有统计学意义.结论 构建的S6K1Ax可将来源于小鼠的细胞系及C57BL/6J小鼠肝脏S6K1基因沉默,为研究S6K1的基因功能提供了适合的实验工具.

摘要：目的:构建能够报告人破骨细胞分化因子(ODF)基因启动子活性的表达载体。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有ODF基因启动子的2段序列(-2433￣-1243bp和-1262￣+100bp),通过T-A克隆将这2个序列片段分别连接到pGEM"-TEasy克隆载体上。利用特定的限制性内切酶位点,将这2个序列片段酶切后进行正确拼接并定向克隆到不含启动子的pEGFP-1报告基因载体上。将该重组质粒pEGFP-1-ODF瞬时转染成骨细胞系UMR106,检测其能否在ODF基因启动子(-2358￣+100bp)的调控下表达报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。结果:pEGFP-1-ODF经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明,pEGFP-1-ODF转染的UMR106能表达EGFP。结论:人ODF基因启动子报告载体的成功构建,为进一步研究ODF基因表达转录水平的调控机制奠定了基础。

摘要：背景:在糖尿病合并有溃疡创面的动物实验中,各种生长因子单药或联合治疗都有报道。但是以纳米微球作为表皮生长因子载体进行糖尿病溃疡愈合的研究作者未检索到。目的:比较重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)纳米微球和rhEGF原液2种不同剂型修复糖尿病大鼠溃疡效果的差异。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-02在卫生部及天津市激素与发育重点实验室完成。材料:rhEGF原液由深圳华生元基因工程有限公司提供[rhEGF含量为1μg(500U)],rhEGF纳米微球[rhEGF含量为1μg(500U)]、空纳米微球由天津医科大学代谢病医院与天津大学材料学院纳米生物技术研究所联合制备,并完成鉴定。方法:88只SD大鼠尾静脉注射链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,用打孔器制备糖尿病大鼠溃疡模型。随机分为4组:rhEGF纳米微球组24只给予rhEGF纳米微球,rhEGF原液组24只给予rhEGF原液,空微球组24只给予空微球(与rhEGF纳米微球质量相同),PBS溶媒对照组16只给予PBS。各组均于造模后第1天开始用注射器将溶解好的药物均匀的喷洒在创面,待作用5min后用无菌纱布包扎。第1天给液量为0.12mL,以后根据创面愈合情况逐渐减少给液量。主要观察指标:于3,7,14,21d计算创面愈合率。同时取创面肉芽组织,免疫组织化学染色测增殖核细胞抗原阳性表达情况,透射电镜观察成纤维细胞超微结构改变。结果:从第14天开始,rhEGF纳米微球组创面愈合率、增殖核细胞抗原阳性细胞率高于rhEGF原液组(P<0.05,P<0.01)。透射电镜下可见rhEGF纳米微球组成纤维细胞胞质内有大量的内质网,扩张成池状,腔内充满了合成的胶原蛋白。结论:与rhEGF原液比较,rhEGF纳米微球促进溃疡愈合更快。

摘要：目的构建mi R-223敲减慢病毒,为进一步研究mi R-223的功能提供工具。方法采用Invitrogen公司mi R-RNAi在线设计工具,根据mi R-223成熟体序列设计了一对互补寡核苷酸片段,退火产物连接至pc DNA6.2-GW/Em GFP-mi R载体,经酶切连入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP载体,构建了mi R-223敲减慢病毒质粒,利用293T细胞将其包装成病毒,并感染ST2细胞,观察感染效率并用q RT-PCR检测mi R-223成熟体表达。结果酶切鉴定及测序结果显示成功构建了mi R-223敲减慢病毒载体,mi R-223敲减慢病毒包装并感染靶细胞,表达绿色GFP荧光蛋白的细胞约占细胞总数的80%-90%,病毒滴度为1×10^9PFU/m L,感染效率达90%。感染mi R-223敲减慢病毒的细胞mi R-223表达量（0.31±0.03）低于阴性对照（1.00±0.09）,为阴性对照的31%,差异有统计学意义（n=3,t=15.091,P〈0.05）。结论成功构建了mi R-223敲减慢病毒,为进一步研究mi R-223的功能准备了条件。

摘要：目的探讨siRNA下调转化生长因子β受体Ⅰ(TGFBRⅠ)基因表达后对ST2细胞向脂肪细胞分化的作用。方法设计并合成针对TGFBRⅠ的靶向si RNA作为实验组,以转染Control si RNA作为对照组。应用q RT-PCR检测并比较转染ST2细胞后各组TGFBRⅠm RNA的表达和脂肪细胞特异性转录因子CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)α、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、脂肪细胞表征因子FABP4 m RNA的表达水平。诱导5 d后对2组细胞进行油红O染色,检测TGFBRⅠsi RNA对ST2细胞分化的影响。利用激光共聚焦显微镜观察脂肪细胞的染色情况并对细胞进行拍照。另外,用异丙醇萃取出油红O,测定油红O在波长520 nm处的光密度(OD)值,并进行组间比较。结果转染TGFBRⅠsi RNA后,ST2细胞TGFBRⅠ基因的表达水平明显下调,TGFBRⅠsi RNA能够促进脂肪细胞生成,增强C/EBPα、PPARγ及FABP4 m RNA表达;经成脂诱导5 d后,转染TGFBRⅠsi RNA的细胞产生的脂滴明显较Control si RNA组多,且OD值高于Control si RNA组。结论 TGFBRⅠsi RNA能有效促进脂肪细胞的分化,提示TGFBRⅠ可能是前体细胞向脂肪细胞分化的重要调控因子。

摘要：目的构建miR-196b海绵吸附慢病毒载体,为研究miR-196b在骨髓基质细胞系中的功能奠定基础。方法根据miR-196b的成熟体序列设计与之互补的串联的六重复序列设计成引物,通过PCR反应将该六重复序列亚克隆至pUC19质粒中,再经酶切连接至pLVX-shRNA2慢病毒载体,利用293T细胞将构建成功的miR-196b海绵吸附慢病毒载体进行病毒包装和滴度测定,pLVX-shRNA2慢病毒作为对照组,miR-196b海绵吸附慢病毒作为实验组,将其感染ST2细胞,观察感染效率,并通过Western blotting检测miR-196b靶基因叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白水平。结果酶切鉴定和测序结果正确,慢病毒包装所测滴度为1×108PFU/mL,将其感染靶细胞,其感染效率达80%。Western blotting结果显示,与对照组相比,其靶基因FoxO1蛋白表达水平有明显增加(P<0.05)。结论成功构建了miR-196b海绵吸附慢病毒载体,并能有效吸附内源性的miR-196b,从而发挥其抑制作用。

摘要：目的探讨利用siRNA下调骨髓基质细胞系ST2细胞中Spry1的内源性表达对脂肪细胞分化的调控作用。方法设计Spry1的靶向si RNA作为实验组,以转染Control si RNA作为对照组。在ST2细胞中转染Spry1si RNA和Control si RNA并进行成脂诱导,应用q RT-PCR检测2组细胞中的Spry1和成脂特异性因子过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)α、脂肪细胞表征因子FABP4、脂肪因子adipsin的m RNA表达水平。脂肪细胞分化成熟后,进行油红O染色,显微镜下观察脂肪细胞的染色情况及Spry1 si RNA对ST2细胞成脂分化的影响。运用异丙醇萃取染色的脂肪细胞中的油红O并测定波长在520 nm处的光密度(OD)值。结果转染Spry1 si RNA于ST2细胞后,与转染Control si RNA的对照组相比,Spry1基因的表达水平明显下调,Spry1 si RNA可抑制脂肪细胞的分化,油红O染色显示实验组的脂肪细胞明显减少且OD值低于对照组;转染Spry1si RNA实验组的成脂特异性因子PPARγ、C/EBPα、FABP4、adipsin的m RNA表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Spry1 siRNA可有效抑制前体细胞向脂肪细胞分化。