摘要：目的应用基因芯片技术进行北方汉族人群HLAⅠ、Ⅱ类抗原中分辨度分型研究，建立稳定的HLA检测芯片。方法采用寡核苷酸芯片分型方法，选择了中国人群基因频率较高的等位基因，同时考虑遗传的连锁不平衡，根据HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB、HLA-DQA不同基因亚型的独特序列，完成了探针的设计与筛选，共设计了213条探针（HLA-A56条，HLA-B66条，HLA-DQA22条，HLA-DQB38条，HLA-DR31条）制成基因分型芯片。采用带荧光标记的引物，用合适的PCR方法扩增HLAⅠ、Ⅱ类抗原上的多态性区域，产物与芯片上探针杂交。杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断，以此确定样品基因型。结果所有样本的HLAⅠ、Ⅱ类抗原基因分型均获成功。此中分辨度探针可分出598个Ⅰ类抗原等位基因，511个Ⅰ类抗原等位基因，可捡出Ⅰ类抗原特异性57个，Ⅱ类抗原特异性30个。结论基因芯片用于HLAⅠ、Ⅱ类抗原分型可行。其分辨率高、特异性强，可用于HLA基因分型、骨髓移植、器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗传性疾病的人群筛查。

摘要：目的:构建能够报告人破骨细胞分化因子(ODF)基因启动子活性的表达载体。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有ODF基因启动子的2段序列(-2433￣-1243bp和-1262￣+100bp),通过T-A克隆将这2个序列片段分别连接到pGEM"-TEasy克隆载体上。利用特定的限制性内切酶位点,将这2个序列片段酶切后进行正确拼接并定向克隆到不含启动子的pEGFP-1报告基因载体上。将该重组质粒pEGFP-1-ODF瞬时转染成骨细胞系UMR106,检测其能否在ODF基因启动子(-2358￣+100bp)的调控下表达报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。结果:pEGFP-1-ODF经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明,pEGFP-1-ODF转染的UMR106能表达EGFP。结论:人ODF基因启动子报告载体的成功构建,为进一步研究ODF基因表达转录水平的调控机制奠定了基础。

摘要：目的构建mi R-223敲减慢病毒,为进一步研究mi R-223的功能提供工具。方法采用Invitrogen公司mi R-RNAi在线设计工具,根据mi R-223成熟体序列设计了一对互补寡核苷酸片段,退火产物连接至pc DNA6.2-GW/Em GFP-mi R载体,经酶切连入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP载体,构建了mi R-223敲减慢病毒质粒,利用293T细胞将其包装成病毒,并感染ST2细胞,观察感染效率并用q RT-PCR检测mi R-223成熟体表达。结果酶切鉴定及测序结果显示成功构建了mi R-223敲减慢病毒载体,mi R-223敲减慢病毒包装并感染靶细胞,表达绿色GFP荧光蛋白的细胞约占细胞总数的80%-90%,病毒滴度为1×10^9PFU/m L,感染效率达90%。感染mi R-223敲减慢病毒的细胞mi R-223表达量（0.31±0.03）低于阴性对照（1.00±0.09）,为阴性对照的31%,差异有统计学意义（n=3,t=15.091,P〈0.05）。结论成功构建了mi R-223敲减慢病毒,为进一步研究mi R-223的功能准备了条件。

摘要：目的探讨siRNA下调转化生长因子β受体Ⅰ(TGFBRⅠ)基因表达后对ST2细胞向脂肪细胞分化的作用。方法设计并合成针对TGFBRⅠ的靶向si RNA作为实验组,以转染Control si RNA作为对照组。应用q RT-PCR检测并比较转染ST2细胞后各组TGFBRⅠm RNA的表达和脂肪细胞特异性转录因子CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)α、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、脂肪细胞表征因子FABP4 m RNA的表达水平。诱导5 d后对2组细胞进行油红O染色,检测TGFBRⅠsi RNA对ST2细胞分化的影响。利用激光共聚焦显微镜观察脂肪细胞的染色情况并对细胞进行拍照。另外,用异丙醇萃取出油红O,测定油红O在波长520 nm处的光密度(OD)值,并进行组间比较。结果转染TGFBRⅠsi RNA后,ST2细胞TGFBRⅠ基因的表达水平明显下调,TGFBRⅠsi RNA能够促进脂肪细胞生成,增强C/EBPα、PPARγ及FABP4 m RNA表达;经成脂诱导5 d后,转染TGFBRⅠsi RNA的细胞产生的脂滴明显较Control si RNA组多,且OD值高于Control si RNA组。结论 TGFBRⅠsi RNA能有效促进脂肪细胞的分化,提示TGFBRⅠ可能是前体细胞向脂肪细胞分化的重要调控因子。

摘要：目的构建miR-196b海绵吸附慢病毒载体,为研究miR-196b在骨髓基质细胞系中的功能奠定基础。方法根据miR-196b的成熟体序列设计与之互补的串联的六重复序列设计成引物,通过PCR反应将该六重复序列亚克隆至pUC19质粒中,再经酶切连接至pLVX-shRNA2慢病毒载体,利用293T细胞将构建成功的miR-196b海绵吸附慢病毒载体进行病毒包装和滴度测定,pLVX-shRNA2慢病毒作为对照组,miR-196b海绵吸附慢病毒作为实验组,将其感染ST2细胞,观察感染效率,并通过Western blotting检测miR-196b靶基因叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白水平。结果酶切鉴定和测序结果正确,慢病毒包装所测滴度为1×108PFU/mL,将其感染靶细胞,其感染效率达80%。Western blotting结果显示,与对照组相比,其靶基因FoxO1蛋白表达水平有明显增加(P<0.05)。结论成功构建了miR-196b海绵吸附慢病毒载体,并能有效吸附内源性的miR-196b,从而发挥其抑制作用。

摘要：目的探讨利用siRNA下调骨髓基质细胞系ST2细胞中Spry1的内源性表达对脂肪细胞分化的调控作用。方法设计Spry1的靶向si RNA作为实验组,以转染Control si RNA作为对照组。在ST2细胞中转染Spry1si RNA和Control si RNA并进行成脂诱导,应用q RT-PCR检测2组细胞中的Spry1和成脂特异性因子过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)α、脂肪细胞表征因子FABP4、脂肪因子adipsin的m RNA表达水平。脂肪细胞分化成熟后,进行油红O染色,显微镜下观察脂肪细胞的染色情况及Spry1 si RNA对ST2细胞成脂分化的影响。运用异丙醇萃取染色的脂肪细胞中的油红O并测定波长在520 nm处的光密度(OD)值。结果转染Spry1 si RNA于ST2细胞后,与转染Control si RNA的对照组相比,Spry1基因的表达水平明显下调,Spry1 si RNA可抑制脂肪细胞的分化,油红O染色显示实验组的脂肪细胞明显减少且OD值低于对照组;转染Spry1si RNA实验组的成脂特异性因子PPARγ、C/EBPα、FABP4、adipsin的m RNA表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Spry1 siRNA可有效抑制前体细胞向脂肪细胞分化。