摘要：目的:构建小鼠原始生殖细胞(PGCs)报告基因系统。方法:根据CRISPR基因编辑技术结合同源重组原理,针对鼠Prdm1和Dppa3基因的翻译起始位点ATG附近位置分别设计一对sgRNA,并根据Cas9切割位点以及拟插入目的片段构建相应的用于同源重组的供体质粒,将sgRNA与Donor质粒同时转染入小鼠胚胎干细胞(ESCs)中,并利用质粒携带的抗性基因筛选出目标单克隆细胞,并进行基因型鉴定。结果:通过提取单克隆细胞的基因组DNA进行基因型鉴定,PCR和Sanger测序结果显示,单克隆细胞的基因组中,Prdm1和Dppa3基因翻译起始位点后分别成功插入eGFP和mCherry荧光蛋白编码序列。利用细胞因子诱导eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3mESCs(mouse ESCs)定向分化为mPGCs(mouse PGCs),流式细胞仪检测显示诱导分化的mPGCs特异表达eGFP和mCherry荧光信号。结论:成功构建mPGCs报告基因系统,可用于后续研究mPGCs命运决定的分子机制,对于研究小鼠早期胚胎发育过程具有重要意义。

摘要：目的:建立幼年特发性关节炎10p11.21遗传位点敲除的单克隆细胞系。方法:首先利用自身免疫病致病变异的遗传和表观遗传精细定位平台鉴定10p11.21遗传位点可能的因果变异;通过全表型组关联研究(PheWAS)数据库确定这一位点的因果变异与其他疾病的相关性;荧光素酶报告基因实验来验证候选因果变异是否具有转录调控功能;利用CRISPR/Cas9技术将因果变异所在基因组区域进行敲除。结果:生物信息学分析的结果显示10p11.21遗传位点的单核苷酸多态性(SNP)rs7100025的PICS值为0.7057,可能是这一位点的因果变异;PheWAS数据库检索结果显示rs7100025与多种免疫疾病具有显著相关性;rs7100025具有调控基因转录的功能,正向插入包含G等位基因和A等位基因的rs7100025序列可以提高荧光素酶表达水平,并且G等位基因相较于A等位基因效果更加明显;成功设计构建了删除rs7100025所在基因组区域的guide RNA质粒,并在Jurkat细胞系中将rs7100025位点进行敲除。筛选得到的单克隆细胞系的基因型在Sanger测序中得以验证。结论:精细定位幼年特发性关节炎10p11.21遗传位点可能的因果变异rs7100025(PICS值为0.7057),并成功建立这一变异敲除的单克隆Jurkat细胞系,敲除的片段大小为456 bp。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9技术构建ALF转录伸长因子4(AFF4)基因敲除的小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10),自主制备特异的AFF4多克隆抗体。方法:设计一对分别靶向小鼠Aff4基因第3个外显子和第4个内含子的向导RNA(sgRNA)。将构建成功的重组质粒转染至B16-F10细胞中,并利用抗性筛选出单克隆细胞,进行基因型鉴定和AFF4表达水平检测。验证自主制备的AFF4多克隆抗体的特异性。结果:通过基因组DNA鉴定获得两株正确的单克隆细胞系,其Aff4基因mRNA水平(t=53.08,P<0.001)和AFF4蛋白表达水平(t=15.17,P<0.001)显著降低。免疫共沉淀实验和蛋白免疫印迹实验证明自主制备的抗人/鼠AFF4多克隆抗体特异性良好(t=264.7,P<0.0001)。结论:成功构建了Aff4基因敲除的B16-F10稳定细胞系,并且成功制备抗AFF4蛋白的多克隆抗体。

摘要：新医科建设注重培养综合素质的医学人才。依托基础医学国家级实验教学示范中心,为了探讨科研与教学融合的实验教学模式,文章基于细胞与分子生物学实验整合课程开展试点项目,采用教师引导联合翻转课堂的方式将科研新技术、新方法融入分子克隆实验。这种实验设计既可以培养学生的创新能力及提高科研素养,又促进科研与教学的有机结合,还可以为学生今后的临床及科研工作奠定基础,为进一步在本科生实验教学中推广起到示范作用。

摘要：将综合性实验引入医学细胞生物学实验课教学,是医学细胞生物学实验课改革的一项重要内容。该课题的H2O2对N2a(mouseneuroblastomaN2a)细胞活性影响这一综合性实验,涉及细胞生物学相关的基础知识和细胞培养、细胞活力测定、细胞计数等一些基本的实验技术,需要学生独立进行实验设计、实验准备、实验操作和实验数据处理。该综合性实验在巩固学生基础知识、训练学生基本实验技能的同时,能够提高学生的综合实验能力、创新思维能力以及培养其严谨的科研素养。

摘要：目的:利用PCR法鉴定酿酒酵母a、α单倍体或a/α双倍体三种接合型。方法:根据酿酒酵母a、α或a/α三种接合型MAT基因座及附近序列信息,分别设计特异的寡核苷酸引物。提取酿酒酵母DNA作为模版和利用单菌落PCR法,进行特异性PCR扩增。结果:MATa基因座特异性引物能在a和a/α接合型中扩增出特异性条带;MATα基因座特异性引物则能在α和a/α接合型中扩增出特异性条带。结论:利用PCR鉴定酿酒酵母接合型是一种操作简单、准确灵敏的方法,为基础医学单细胞真核模式生物的研究提供方便。

摘要：[目的]构建抵抗shRNA的同义突变SND1慢病毒质粒,并在SND1敲低的卵巢癌细胞系中回复表达SND1。[方法]依据密码子的简并性,针对shRNA识别的序列(TCTCGTCTCAAACTCTATTTG)设计同义突变序列(TAGGTATAACTTTAACCTGCT)并通过重叠延伸PCR的方法将同义突变序列引入SND1的编码序列中,得到recombination SND1(rSND1)目的片段,与pLVX-IRES-Hyg载体连接。测序验证pLVX-FLAG-rSND1质粒序列。pLVX-FLAG-rSND1质粒与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-rSND1的慢病毒毒粒。用慢病毒感染SND1敲低的卵巢癌SKOV3-sh SND1-2细胞株,经潮霉素B筛选后,用Western Blot检测FLAG和SND1的表达。[结果]抵抗shRNA的真核pLVX-FLAG-rSND1重组慢病毒质粒构建成功,可检测到FLAG及SND1的表达。[结论]成功构建了同义突变SND1的pLVX-FLAG-rSND1质粒并在卵巢癌细胞中回复表达,为继续研究SND1蛋白在卵巢癌中的功能奠定了基础。

摘要：目的:构建尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)启动子区的双荧光素酶报告质粒并检测其活性,从而验证SND1蛋白对NNMT基因的调控作用。方法:根据NNMT基因启动子区上、下游-1500至+200区间的序列设计引物,并以HepG2细胞提取的RNA逆转录得到cDNA为模板进行PCR扩增,得到的NNMT启动子区片段经酶切后连接到双荧光素报告载体GLuc-ONTM启动子报告克隆中,得到Gluc-NNMT启动子重组质粒,分别与pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1质粒和pLVX-IRES-Puro-vector质粒共同转染HeLa细胞,并检测启动子活性。然后用免疫共沉淀的方法验证NNMT蛋白是否与SND1蛋白之间存在相互作用。结果:重组质粒构建成功。双荧光素酶活性实验显示,共转染Gluc-NNMT启动子重组质粒和pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1过表达质粒的实验组与对照组相比,NNMT启动子区活性明显增强。结合免疫共沉淀实验结果,证明NNMT与SND1存在相互作用。结论:成功构建了NNMT启动子双荧光素酶报告质粒,SND1对NNMT启动子活性有增强作用,SND1与NNMT蛋白之间存在相互作用。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9n系统在NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系中敲除Asxl2基因。方法设计一对靶向小鼠Asxl2基因第5个外显子的小向导RNA(sg RNA),分别克隆进p X462载体。将测序鉴定正确的重组质粒转染至NIH3T3细胞中,利用有限稀释法得到单细胞,通过培养获得单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组DNA,ge-notyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并测序。利用Western blot方法检测细胞株中Asxl2的敲除效果。结果成功构建靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒。将2个重组质粒共转染NIH3T3细胞,嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系,并且经genotyping PCR测序验证得到一株正确的单克隆细胞系。Western blot证实敲除Asxl2后,该NIH3T3细胞系中Asxl2蛋白表达缺失。结论通过这个系统得到了靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒及稳定敲除Asxl2的NIH3T3细胞系。

摘要：目的运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在人恶性横纹肌样瘤细胞株G401中敲除p21基因。方法通过反转录定量PCR(RT-q PCR)及Western blot检测各瘤细胞株中p21的表达,针对p21基因作用的功能域,设计了靶向人p21基因第3个外显子的向导RNA(sg RNA),克隆入lenti CRISPR v2载体。将测序及酶切鉴定正确的重组质粒在293T工具细胞中制备慢病毒颗粒并感染G401细胞,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,显微镜下挑取单克隆细胞团并继续培养获得G401单克隆细胞株。提取单克隆细胞株RNA及蛋白,利用RT-q PCR及Western blot方法检测细胞株中p21的敲除效果。结果 p21在人横纹肌样瘤细胞中高表达。成功构建靶向p21基因的lenti CRISPRv2-sg RNA重组慢病毒质粒。与对照组相比,筛选得到的G401亚克隆细胞系中p21蛋白表达缺失。结论针对难转染的G401细胞,应用CRISPR/Cas9系统成功构建了p21基因敲除的稳定株,为后续深入研究p21在人恶性横纹肌样瘤中的作用机制奠定了基础。