摘要：新医科建设注重培养综合素质的医学人才。依托基础医学国家级实验教学示范中心,为了探讨科研与教学融合的实验教学模式,文章基于细胞与分子生物学实验整合课程开展试点项目,采用教师引导联合翻转课堂的方式将科研新技术、新方法融入分子克隆实验。这种实验设计既可以培养学生的创新能力及提高科研素养,又促进科研与教学的有机结合,还可以为学生今后的临床及科研工作奠定基础,为进一步在本科生实验教学中推广起到示范作用。

摘要：基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。

摘要：CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术是近年来新兴的一种可以实现基因特异性敲除和敲入的技术。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,将3×FLAG标签定点敲入HeLa细胞SND1基因前方,使细胞内源性表达的SND1蛋白带有3×FLAG标签,并观察SND1与应激颗粒及加工体的定位情况。设计针对SND1基因起始密码子ATG附近的sgRNA,以px459为表达载体,构建出重组真核表达质粒。设计含有3×FLAG及待插入位置上下游150 bp同源臂的序列,经公司合成获得重组质粒。将2个质粒共同转染HeLa细胞,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞,挑取单克隆后培养。Western印迹表明,细胞表达3×FLAGSND1融合蛋白质。提取细胞基因组DNA进行测序。测序无误获得稳定株后,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,发现与WT细胞相比无显著性差异。同时,使用05 mmol/L亚砷酸钠处理,细胞发生氧化应激,eIF2α蛋白磷酸化增加,胞浆中出现应激颗粒,SND1与应激颗粒标志蛋白TIAR存在共定位现象,但不存在与加工体蛋白DCP1α的共定位。

摘要：以时间开放、设备开放、空间开放的医学生物化学实验室为依托,在医学生物化学实验教学中开设设计性实验,从学生兴趣点出发,提出“为什么有人喝酒会脸红”的问题,引出设计性实验课题。文章就课程设置、实验选题、课程具体实施过程以及教学效果进行了详细阐述,并分析实施过程中存在问题,提出相应解决对策。旨在通过开放式实验教学改革提高学生自主学习和科研创新能力,实现对科研的早期接触,为更多开放式实验教学课程开设提供借鉴。

摘要：基础医学专业旨在培养具有从事基础医学教育和科学研究能力的拔尖人才。为提高学生的实验操作技能和科研创新能力,天津医科大学生物化学与分子生物学系对基础医学专业的分子生物学实验课程进行了改革与实践。文章分析了前期分子生物学实验课程的不足,介绍了改革后教学内容的调整、仪器设备的改进、培养方式的提升以及教学效果反馈,并探讨了教改后仍存在的问题及拟解决方案。

摘要：[目的]构建抵抗shRNA的同义突变SND1慢病毒质粒,并在SND1敲低的卵巢癌细胞系中回复表达SND1。[方法]依据密码子的简并性,针对shRNA识别的序列(TCTCGTCTCAAACTCTATTTG)设计同义突变序列(TAGGTATAACTTTAACCTGCT)并通过重叠延伸PCR的方法将同义突变序列引入SND1的编码序列中,得到recombination SND1(rSND1)目的片段,与pLVX-IRES-Hyg载体连接。测序验证pLVX-FLAG-rSND1质粒序列。pLVX-FLAG-rSND1质粒与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-rSND1的慢病毒毒粒。用慢病毒感染SND1敲低的卵巢癌SKOV3-sh SND1-2细胞株,经潮霉素B筛选后,用Western Blot检测FLAG和SND1的表达。[结果]抵抗shRNA的真核pLVX-FLAG-rSND1重组慢病毒质粒构建成功,可检测到FLAG及SND1的表达。[结论]成功构建了同义突变SND1的pLVX-FLAG-rSND1质粒并在卵巢癌细胞中回复表达,为继续研究SND1蛋白在卵巢癌中的功能奠定了基础。

摘要：分子生物学实验技术对于培养学生实践动手能力、激发学生对理论知识的学习积极性等方面具有重要意义。基于系统性、综合性、设计性实验思维,学系对初步改革后的分子生物学实验教学体系进行了进一步的升级和改革,增加了综合设计性实验课程及虚拟仿真实验项目,并融入了开放式及PBL式教学模式。改革后的分子生物学实验教学体系,对于培养基础扎实、富有创新精神、实践能力强、综合素质高的创新型人才具有重要促进作用。

摘要：目的:构建尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)启动子区的双荧光素酶报告质粒并检测其活性,从而验证SND1蛋白对NNMT基因的调控作用。方法:根据NNMT基因启动子区上、下游-1500至+200区间的序列设计引物,并以HepG2细胞提取的RNA逆转录得到cDNA为模板进行PCR扩增,得到的NNMT启动子区片段经酶切后连接到双荧光素报告载体GLuc-ONTM启动子报告克隆中,得到Gluc-NNMT启动子重组质粒,分别与pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1质粒和pLVX-IRES-Puro-vector质粒共同转染HeLa细胞,并检测启动子活性。然后用免疫共沉淀的方法验证NNMT蛋白是否与SND1蛋白之间存在相互作用。结果:重组质粒构建成功。双荧光素酶活性实验显示,共转染Gluc-NNMT启动子重组质粒和pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1过表达质粒的实验组与对照组相比,NNMT启动子区活性明显增强。结合免疫共沉淀实验结果,证明NNMT与SND1存在相互作用。结论:成功构建了NNMT启动子双荧光素酶报告质粒,SND1对NNMT启动子活性有增强作用,SND1与NNMT蛋白之间存在相互作用。