摘要：目的:分析体外诊断试剂临床试验中的质量问题,研究制定其质量保证提升措施。方法:汇总医院体外诊断试剂临床试验项目自查发现的质量问题并进行分类,利用帕累托图对其进行统计、分类和分析,确定临床试验中存在问题的主要类型,应用鱼骨图进行根因分析,从试验设计、试验实施和数据总结与报告环节制定质量提高措施。结果:在选取的2013-2019年医院承接体外诊断试剂临床试验的4 235份样本中,共发现质量问题119个,归属10项问题类型,其主要因素为试验记录、试验试剂、方案执行、申报资料、伦理审查及文件和原始记录6项,次要因素为试验样本1项,一般因素有试验人员、知情同意和统计分析3项,应用鱼骨图分析影响试验质量原因,针对临床试验的3个主要环节制定17条质量提升措施。结论:应用帕累托图和鱼骨图分析方法,可梳理出常见的体外诊断试剂临床试验质量问题和原因,制定出体外诊断试剂临床试验质量保证措施,从源头上确保体外诊断试剂临床试验质量。

摘要：背景:骨组织工程的支架材料主要作用为模拟细胞体内生长的空间环境,为细胞形成骨组织提供三维支架载体,但目前尚缺乏理想载体材料。目的:应用纤维蛋白胶作为细胞支架进行兔骨髓基质细胞立体培养,探讨其作为骨组织工程支架材料的可行性。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-09/2008-01在吉林大学中日联谊医院及天津科技大学机械工程学院完成。材料:将纤维蛋白原和凝血酶按不同比例混合,制备不同强度的纤维蛋白胶。1月龄雄性新西兰大耳白兔1只,体质量0.25kg。方法:以兔骨髓基质细胞作为种子细胞在CO2孵箱中进行传代培养后,收集扩增的骨髓基质细胞与支架材料纤维蛋白胶复合后再进行培养4周。主要观察指标:采用相差显微镜观察纤维蛋白胶中培养的骨髓基质细胞的生长状况,以苏木精-伊红染色观察不同时期纤维蛋白胶中骨髓基质细胞的活性,以电子显微镜观察培养4周后骨髓基质细胞超微结构变化。结果:骨髓基质细胞在不同强度的纤维蛋白胶中的生长状态不同,在低强度纤维蛋白胶中活性好,扩增迅速,而在高强度纤维蛋白胶中细胞生长缓慢,数量少或逐渐死亡。电镜观察纤维蛋白原和凝血酶比例为4∶1的纤维蛋白胶培养4周的基质细胞,各细胞器清晰可见,细胞具有良好活性。结论:骨髓基质细胞在低强度形成固体时的纤维蛋白胶中能够良好扩增生长,以纤维蛋白原和凝血酶比例为4∶1的效果最佳。

摘要：目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测Ct值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150份粪便标本,多重荧光定量PCR的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义(χ2=6.91,P>0.05)。多重荧光定量PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。

摘要：目的本研究探讨hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞生物学特性及环氧化酶-2(COX-2)的影响。方法设计合成特异性针对hTERT mRNA的siRNA,电转染入乳腺癌细胞,以致目的基因沉默。应用RT-PCR及Western blot法检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白的表达状况;应用流式细胞仪检测细胞周期;并通过CCK-8增殖实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力;经小室侵袭实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。利用免疫组织化学法检测COX-2蛋白的表达。结果 hTERT基因沉默48h后,hTERT转染组在沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白表达呈现明显降低(P<0.05);细胞周期检测结果示乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,三组比较统计学差异明显(P<0.05);CCK-8增殖实验结果表明乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞在hTERT转染组的增殖得到显著抑制(P<0.05);小室侵袭实验结果表明,hTERT转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P<0.05);免疫组织化学法检测结果显示,COX-2蛋白在hTERT转染组的表达明显降低,并与hTERT基因的表达相关联。结论 hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞的增值和迁移能力均有影响,并能降低COX-2蛋白的表达,从而改善乳腺癌患者预后。

摘要：目的比较正常乳腺细胞HBL-100与雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中CHD5表达水平。初步探讨CHD5基因与雌激素受体阴性乳腺癌发生发展的相互关系及分子机制。方法应用RT-PCR法检测CHD5基因在HBL-100细胞和MDA-MB-231细胞中含量的差异;设计合成靶向CHD5的小干扰序列,构建RNA干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-CHD5,抑制CHD5基因的表达,并检测乳腺癌相关基因HER-2的表达情况。结果CHD5基因在HBL-100中高表达,在MDA-MB-231中低表达。酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰HBL-100细胞CHD5基因的表达。干扰后,HBL-100细胞中CHD5表达被抑制,HER-2表达升高,呈负相关性。结论 CHD5的缺失或低表达可能与雌激素受体阴性乳腺癌的发生发展有关,为CHD5基因可能成为雌激素受体阴性乳腺癌治疗的新靶点提供理论依据。

摘要：目的:探讨烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)在肾癌中的表达情况及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过TCGA在线数据库ualcan分析NAMPT在肾癌组织和正常肾组织中的表达,通过Kaplan-Meier plotter数据库分析NAMPT对肾癌预后的影响。qPCR检测NAMPT基因在肾癌细胞769P、A704、786-O及正常化肾小管上皮细胞HK2中的表达。分别设计NAMPT特异性shRNA(shNAMPT组)和对照序列(scramble组)转染肾癌细胞786-O,用NAMPT抑制剂FK866及对照试剂DMSO处理肾癌细胞786-O,分别采用CCK-8法、平板克隆实验及流式细胞术检测NAMPT对肾癌细胞786-O增殖、克隆形成及凋亡的影响,NAD+/NADH检测试剂盒检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的含量,Western印迹检测NAMPT的表达及干扰NAMPT对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路的影响。结果:生物信息学分析显示NAMPT在肾癌中的表达高于正常肾组织(P<0.05),NAMPT高表达组总生存率较低表达组明显降低(P<0.01);肾癌细胞769P、A704、786-ONAMPT的表达均高于肾小管上皮细胞HK2(t=6.680,P=0.0026,t=14.12,P=0.001,t=13.43,P=0.002);细胞学实验结果显示,与DMSO组相比,FK866组肾癌细胞786-O的增殖能力减弱(t=2.625,P<0.05),克隆形成能力明显受抑制(t=5.687,P<0.01),凋亡细胞比例增高(t=6.325,P<0.01),NAD+生成明显下降(t=17.62,P<0.001)。与scramble组相比,shNAMPT组肾癌细胞786-O的增殖能力减弱(t=3.959,P<0.05),克隆形成能力明显受抑制(t=8.684,P<0.05),凋亡细胞比例增高(t=14.05,P<0.01),NAD+生成明显下降(t=10.93,P<0.001),Akt通路关键蛋白p-PI3K及p-Akt的表达明显下调(t=7.721,P<0.01,t=14.78,P<0.001)。结论:NAMPT在肾癌中高表达,且与患者预后差相关,干扰NAMPT的表达,可以通过减少NAD+的生成,抑制PI3K/Akt通路的激活,从而降低肾癌细胞的增殖,促进其凋亡。

摘要：为构建一种高表达高亲和力IgE受体α链(high affinity IgE receptor alpha chain, FcεR1α)和共表达新型标志物神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的RBL-2H3细胞模型并鉴定其活性,设计FcεR1α-NPY-EGFP序列,构建表达载体pLV-Puro-FcεR1α-T2A-NPY-EGFP-TYK2,对其进行测序鉴定后无内毒素大量提取;经脂质体Lipo2000瞬时转染,于48 h后通过荧光定量PCR、Western blotting、FACS鉴定FcεR1α表达水平;通过传统β-氨基己糖苷酶介质释放试验检测受体的活性,通过NPY-EGFP释放试验检测新型指标的功能。经基因水平、蛋白质水平、膜蛋白表达及功能试验鉴定FcεR1α位于RBL-2H3细胞膜上并有结合人特异性IgE(specific IgE, sIgE)的活性,新型标志物NPY-EGFP可以受刺激分泌。该研究成功构建了一种高表达FcεR1α和共表达新型标志物NPY-EGFP的细胞模型用于检测人血清sIgE。

摘要：目的研究住院患者Caprini血栓风险模型与9项血浆血栓风险标志物的相关性，评价2种方法诊断静脉血栓栓塞（venousthromboembolism，VTE）风险的价值。方法采用回顾性队列分析研究设计。选择天津医科大学总医院2009--2012年间收治的1066例住院患者，男685例，女38l例，年龄19-81岁。采用ILACLTOP700型血液凝固仪、SysmexCA7000血液凝固仪和Vidas荧光免疫分析仪测定待检者血管性血友病因子抗原含量（vWF：Ag）、凝血因子Ⅶ活性（FVⅡ：A）、凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：A）、抗凝血酶活性（AT：A）、蛋白C活性（PC：A）、游离蛋白S含量（FPS：Ag）、纤溶酶原激活抑制物活性（PAI：A）、组织型纤溶酶原激活物（t-PA：A）、D-二聚体（D-D）水平。采用受试者工作特征（receptoroperatingcharacteristic，ROC）曲线评价血栓风险标志物的诊断效能，采用Spearman相关分析血栓标志物水平与Caprini风险模型的相关性，用Kaplan-Meier曲线进行生存分析。结果Caprini风险模型5组间的各项血栓风险标志物水平差异均有统计学意义（D-D、t-PA：A、PAI：A的H值分别为7．530、3．221和4．974，vWF：Ag、FⅧ：A、FⅧ：A、PC：A、FPS：A、AT：A的F值分别为6．395、3．887、4．062、2．905、3．218、5．469，P均〈0．01），且与不同分值Caprini风险模型呈显著相关（D-D、vWF：Ag、FVII：A、FⅧ：A、PC：A、FPS：Ag、AT：A、t-PA：A、PAl：A的r分别为0．805、0．781、0．433、0．509、-0．244、-0．496、-0．263、0．692，P均〈0．01或0．05）。经ROC曲线分析，D-D和vWF：Ag对极高危风险和VTE患者的诊断效能优于其他标志物（D．D敏感度和特异度分别为82．1％和53．9％、94．7％和51．7％；vWF：Ag分别为71．4％和60．9％、81-3％和61．0％）。极高危组（1组与2组）和血浆D．D水平高于临界值（1024gg／L）的患者在30d内有更高的VTE累积风险（Log-rank#分别为65．092和20．785，P均=0．000）。结论9项血栓风险标志物与Caprini风险分层具有相关性，D．D诊断VTE和Caprini极高危风险的效能优于其他8项指标，血栓标志物能敏感反映患者隐匿性凝血紊乱，且与Caprini风险模型在临床应用中具有互补性。

摘要：目的:探讨多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测6种常见呼吸道病原菌的检测方法。方法:采用BeaconDesigner7.9设计引物和探针建立MRT-PCR法,通过构建质粒标准品分析该方法的最低检出限。对176例临床标本中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌进行回顾性检测,并用一代基因测序验证。结果:MRT-PCR法检测病原菌的最低检出限达103 copies/mL,大肠埃希菌19例,金黄色葡萄球菌30例,铜绿假单胞菌37例,肺炎克雷伯菌53例,阴沟肠杆菌15例,鲍曼不动杆菌22例,与传统鉴定方法报告病原菌一致,特异性达100%。通过一代基因测序结果完全符合。结论:使用多荧光通道PCR仪,采用多重PCR技术检测痰液标本中6种常见病原菌的基因检测方法,敏感性和特异性高,提高了检测效率。

摘要：蛋白激酶C(PKC)是一组磷脂依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶G(PKG)共同构成丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AGC超家族。PKC包括传统型PKC、新型PKC、非典型PKC和与PKC相关的一些激酶(PRK)成员。PKC广泛分布于哺乳动物的组织和细胞中,对细胞的生长代谢、增殖分化等起着重要的生物学作用。研究表明,多种细胞的变异和疾病的发生发展都与PKC的异常表达有关。因此,设计和寻找高效的PKC抑制剂对于多种有效药物的合成和临床上包括肿瘤、心血管疾病、高血压等多种疾病的治疗都具有非常重要的意义。近年来,关于PKC抑制剂的研究已经成为国内外研究的焦点。大量文献报道了多种有效的PKC抑制剂,并对其作用位点、作用机制以及临床试验数据等进行了分析。这些PKC抑制剂的发现对于PKC的结构分析和疾病的治疗具有重要的意义。因此,本文对这些高效的PKC抑制剂进行综述。