摘要：【目的】构建小鼠Krüppel样因子4 RNA干扰慢病毒表达载体,并观察KLF4基因在小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞中的表达情况。【方法】根据Gen Bank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,合成、制备KLF4-sh RNA DNA片段,与载体连接构建真核表达慢病毒干扰载体p LVX-KLF4-sh RNA,转化感受态,筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。在Lipofectamine~?3000的介导下,p LVX-KLF4-sh RNA1/2与ps PAX2、p MD2.G辅助质粒共转染293T细胞,包装产生病毒Lenti-KLF4 1/2,将重组的慢病毒感染RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测KLF4 m RNA的表达。收集病毒上清并浓缩测定病毒滴度。【结果】经测序证实,沉默小鼠KLF4基因的真核表达慢病毒干扰载体构建成功,倒置荧光显微镜下可见包装细胞293T细胞表达绿色荧光,RT-PCR证实RAW264.7细胞中KLF4 m RNA的敲除效率分别在60%、75%左右(P<0.05)。初次浓缩后测定小鼠KLF4基因重组慢病毒的滴度为1.65×108TU/ml。【结论】成功构建出KLF4的RNA干扰慢病毒载体p LVX-KLF4-sh RNA 2可用,并包装出慢病毒,为本实验在后续的体内体外研究中探讨KLF4的作用机制奠定了实验基础。

摘要：目的应用RNA干扰技术构建小鼠P2X_7受体(P2X_7R)基因重组慢病毒载体并鉴定。方法对小鼠P2X_7R mRNA分析,设计合成单链引物,经退火后形成双链寡核苷酸序列,放入经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,连接构建慢病毒干扰载体pLVX-shRNA-P2X_7R。筛选出阳性克隆,进行基因测序鉴定。测序验证正确后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清。经浓缩后感染小鼠RAW264.7细胞,采用流式细胞术评价病毒滴度及感染效率;利用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法鉴定P2X_7R shRNA慢病毒的干扰效率。结果测序证实,成功地构建了重组质粒pLVX-shRNA-P2X_7R及小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。重组慢病毒的滴度为2×1010TU·L^(-1),感染效率约为95%。干扰效率约为70%。结论应用RNA干扰技术可成功构建小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。

摘要：目的探讨不同免疫方案建立Balb/c小鼠实验性自身免疫性心肌炎模型的优劣。方法取6周龄雄性Balb/c小鼠,设计三种造模方案,并均设正常对照组和模型组。经不同方案免疫动物后行动物超声影像系统检测心功能,病理形态观察心肌炎症和纤维化,并计算心指数和脾指数,qRT-PCR检测小鼠心脏和脾脏组织TLR2、TLR4基因的表达水平。结果与正常对照组相比,方案一中模型组小鼠心指数和脾指数无明显差异,超声检测中射血分数(EF)及各室壁厚度均无明显差异,心肌炎症改变不明显,纤维化不明显,TLR2、TLR4mRNA的表达量无明显变化;方案二中模型组EF、左室舒张末内径(LVEDd)以及左室收缩末内径(LVEDs)明显降低,但舒张期室间隔厚度(IVSd)及收缩期室间隔厚度(IVSs)与对照组相比无统计学意义;病理形态观察可见心肌出现少量单核细胞浸润,心肌细胞肿胀,心肌间质及外膜可见少量的纤维化,同时脾指数明显增加,心脏与脾脏组织TLR2、TLR4的mRNA表达量无明显变化;方案三中模型组EF、LVEDd、LVEDs均明显降低,而IVSd及IVSs未见显著改变,病理学检测可见心肌大量炎细胞浸润,心肌细胞肿胀,心肌间质及外膜可见少量的纤维化,伴有脾指数的显著增加,心脏与脾脏组织TLR2 mRNA的表达量升高,而TLR4的mRNA表达量无明显变化。结论与方案一模型组和方案二模型组相比,方案三模型组的造模效果更好,其免疫方案可用于自身免疫性心肌炎相关研究,具有较好的参考价值。