摘要：[目的]获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵过程中的作用。[方法]将靶向CD 163基因第7外显子的sgRNA质粒(pX330-sgCD163)转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定,通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD 163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和半数细胞培养物感染量(50%tissue culture infective dose,TCID 50)等试验分析CD 163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。[结果]测序结果表明,100株单克隆细胞中有1株CD 163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示,CD 163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达,且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明,与野生型iPAMs组相比,CD 163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低(P<0.01);Western blotting和IFA结果表明,在接毒24 h后的CD 163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达;TCID 50试验结果同样显示,在CD 163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。[结论]本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD 163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。

摘要：为了利用显微注射一步法构建RAG1基因敲除的免疫缺陷猪模型,试验利用CRISPR/Cas9技术针对猪的RAG1基因设计并筛选出高效的sgRNA,与体外转录的Cas9 mRNA按照4∶6比例混合后显微注射到猪体外受精的受精卵中,随后将基因编辑的受精卵移植到受体母猪输卵管内;仔猪出生后采集耳缘皮肤组织提取基因组进行PCR扩增、T7核酸内切酶Ⅰ酶切鉴定,以及利用Sanger法测序鉴定编辑后基因型;监测基因敲除的免疫缺陷仔猪在普通环境的生存周期;对死亡的仔猪进行剖检,采集胸腺和脾脏等免疫器官进行组织学分析。结果表明:通过在猪成纤维细胞系水平上进行RAG1基因敲除效率的筛选,筛选出针对猪RAG1基因第2外显子高效敲除的sgRNA序列,通过对猪受精卵胞质显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,获得2头RAG1基因敲除免疫缺陷仔猪,经鉴定发现RAG1基因的第2外显子碱基序列中有1 bp插入,造成移码突变,破坏了RAG1基因功能,致使仔猪免疫系统缺陷。出生的2头免疫缺陷仔猪在普通饲养环境的存活时间分别为19 d和33 d。RAG1基因敲除的免疫缺陷仔猪胸腺缺失,脾脏发育不良,无法在正常饲养环境中长时间存活。脾脏结构紊乱,出现炎症细胞浸润等免疫系统异常。说明通过CRISPR/Cas9技术进行显微注射可获得RAG1基因敲除的免疫缺陷猪模型。

摘要：[目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。[结果]构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。[结论]本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。

摘要：针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)的rfbE基因保守序列设计特异引物,通过优化反应体系、反应温度和反应时间等参数,建立了一种快速、简便的肠出血性大肠杆菌O157∶H7的环介导等温扩增-横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌O8∶K88和O141∶K99、无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、产单核细胞李氏杆菌、表皮葡萄球菌、肠炎沙门菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等12种细菌均无交叉反应。灵敏度试验结果表明,该方法对纯培养的EHEC O157∶H7的检测下限为13CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测下限为18CFU/mL。研究结果表明,该方法特异性好,灵敏度高,操作简便,可肉眼直接判定结果,1h内完成检测,在食品卫生检验和临床疾病诊断方面具有良好的应用前景。

摘要：试验采用正交设计方法,以白腐真菌菌丝体的生物量为测量指标,对白腐真菌595菌丝体液体培养基进行了筛选,结果表明:白腐菌菌丝体液体培养的最适培养基为,葡萄糖20、蔗糖15、酵母粉2、麦麸15、MgSO4.7H2O0.5、KH2PO41.5g/L和维生素Bl4mg/L。28℃培养7d,其生物量可达11.21g/L。采用最佳培养基进行生长曲线试验,白腐真菌生长曲线为y=21.46/(1+26.47e-0.43x),菌丝体在第9天至13天最高生物量可达20.908g/L。

摘要：从天津地区不同猪场分离到6株H1N1亚型猪源流感病毒(SIV)。根据GenBank发表的H1N1亚型SIV的核蛋白(NP)、基质蛋白(M)及非结构蛋白(NS)基因序列,分别设计3对引物,将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行测序分析。遗传进化分析结果表明:A/swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)的NP、M及NS基因核苷酸序列在遗传进化树中均与A/swine/Guangdong/33/2006(H1N1)位于同一分支上,属于古典型H1N1猪谱系;A/swine/Tianjin/TJ3/2006(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ8/2006(H1N1)的NP、M及NS基因核苷酸在遗传进化树中均与A/Dunedin/2/2000(H1N1)组成一个大分支,可能起源于人谱系;A/swine/Tianjin/TJ6/2009(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ7/2009(H1N1)NP、M及NS基因核苷酸序列在遗传进化树中均与A/swine/Jiangsu/s15/2011(H1N1)位于同一分支上,属于类禽H1N1猪谱系。本试验对6株H1N1亚型SIV的NP、M及NS全基因序列进行分析,在一定程度上揭示了天津地区H1N1亚型SIV的基因进化与流行情况。

摘要：本试验针对猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)NP基因保守区域设计并合成6条引物,建立了SIV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒;该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。结果表明建立的LAMP方法具有较高的敏感性和特异性,可用于SIV的快速检测。

摘要：试验以木醋液为青贮添加剂,设计4个剂量梯度(3、6、9和12mL/kg),以蒸馏水替代木醋液作为对照,探讨其对苜蓿青贮品质的影响。结果表明:(1)木醋液各剂量处理对青贮苜蓿粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、木质素和淀粉含量无显著影响(P>0.05),但12mL/kg剂量处理显著降低了粗脂肪含量(P<0.05);(2)木醋液各剂量处理显著降低了青贮苜蓿酸性洗涤不溶蛋白和中性洗涤不溶蛋白的含量(P<0.05),说明木醋液可在一定程度上提高青贮苜蓿蛋白的利用率;(3)木醋液各剂量处理能显著降低青贮pH值(P<0.05),显著提高乳酸含量(P<0.05),说明木醋液在一定程度上提高了青贮苜蓿发酵品质;(4)隶属函数综合评价显示,木醋液3mL/kg、6mL/kg和9mL/kg可显著提高青贮苜蓿品质(P<0.05),其中以3mL/kg最佳。

摘要：为了研究日粮中不同水平三七提取物(PNS)对产蛋后期蛋鸡鸡蛋品质及免疫功能的影响,采用单因素完全随机分组试验设计,选择同一批次288只55周龄的健康海兰蛋鸡,随机分成4组(每组6个重复,每个重复12只鸡),各组日粮中三七总皂甙(PNS)的添加量分别为0 mg/kg(A组)、50 mg/kg(B组)、100 mg/kg(C组)、150 mg/kg(D组)。饲养试验为期60 d,结果表明,试验C、D组蛋形指数显著高于对照组(P0.05)。试验B组血清Ig A、Ig G含量比对照组高4.41%、10.55%,差异显著(P<0.05),试验C、D组血清C3、C4含量比对照组低12.68%(P<0.05)、12.37%(P<0.05)和8.31%、7.35%,试验B组血清C3、C4含量比对照组高22.6%和35.78%(P<0.05),结果显示,高剂量PNS能降低血清C3、C4含量,低剂量则提高血清C3、C4含量。

摘要：试验旨在研究不同蚯蚓基质发酵前各原料和发酵后基质不同比例的营养价值成分,构建蚯蚓基质营养体系。试验前测定原材料和发酵后配置成基质的风干样品的营养价值成分,设计试验分组:其中,牛粪+蘑菇菌糠质量比为1:0、1:1、1:2、1:3和0:1,牛粪+青贮秸秆C/N为20、25、30、35、40;鸡粪+蘑菇菌糠和鸡粪+秸秆青贮也按上述试验组设置。猪粪+蘑菇菌糠质量比为1:0、1:1、1:2、1:3和1:4,猪粪+青贮秸秆C/N为25、30、35、40、45,每个处理组设置3个重复。根据蚯蚓生长繁殖情况筛选出适宜的基质试验组。试验期60 d。结果表明:牛粪+菌糠质量比1:1、猪粪+菌糠质量比为1:3、鸡粪+菌糠质量比为1:2比较适宜蚯蚓生长,并繁殖较快。牛粪+秸秆C/N比在30~35之间、猪粪+秸秆C/N比为30、鸡粪+秸秆C/N比为25比较适宜蚯蚓生长,并繁殖较快。总体看,粪便与菌糠较粪便与秸秆效果好。