摘要：乙型肝炎病毒核心蛋白HBc,可在体外自组装形成二十面体对称结构的病毒样微粒VLPs。VLPs可将外源序列重复且高密度地展示在表面,VLPs进入机体后能够快速诱导机体产生针对外源性抗原的特异性体液免疫及细胞免疫应答,具有极强的免疫原性与生物活性。因此,HBc-VLPs可以作为一种安全、有效的疫苗载体。文中设计了一种能够实现与抗原定点偶联的HBc-VLPs,并开发了一套高效制备HBc-VLPs的方法。通过定点突变技术,使翻译后的多肽序列第80位氨基酸由Ala变为Cys,在HBc-VLPs的主要免疫显性区域引入一个定点交联位点,构建了原核表达载体pET28a(+)-hbc,表达、纯化获得了高纯度的HBc(A80C)单体蛋白;在PB缓冲体系中,HBc(A80C)蛋白自组装形成HBc-VLPs纳米粒子。粒度仪的测定结果表明,HBc-VLPs纳米微粒的平均粒径为29.8 nm,透射电子显微镜观察到HBc-VLPs形成粒径约为30 nm的球形微粒,其形态与天然的HBV微粒相似。以流感病毒M2e抗原肽为模式抗原,通过Sulfo-SMCC氨基-巯基双功能交联剂,将M2e定点连接于HBc-VLPs通过突变引入的Cys残基处,制备了M2e-HBc-VLPs模式疫苗,通过细胞荧光示踪,验证了HBc-VLPs结构的完整性与M2e的正确交联。动物免疫实验表明该疫苗能够有效刺激小鼠产生抗原特异性的IgG抗体,验证了疫苗载体HBc-VLPs的有效性。研究结果为HBc-VLPs作为疫苗载体的研究奠定了基础,能够促进HBc-VLPs载体疫苗的研发以及HBc-VLPs在其他领域的应用。

摘要：蛋白质药物因其独特的优势,在疾病的预防和治疗中发挥了极其重要的作用,但大分子的特性阻碍了其对细胞内靶标的作用。现有的递送策略中,由于穿膜肽更适用于临床研究和治疗,逐渐成为了递送蛋白质药物最主要的工具。因此,开发安全有效的穿膜肽类递送载体对于生物医药的基础研究及临床应用具有重要意义。文中设计了一种基于肠毒素A2结构域的自释放型细胞内运输载体LCA2,该载体由连接子Linker、自释放酶敏感位点Cs与穿膜结构域LTA2三部分组成,并以荧光蛋白质mCherry为模式蛋白质来检测该载体的性质。电泳结果显示,从含有pET24a(+)-ma2重组质粒的工程菌中获得了高纯度的mCherry-LCA2融合蛋白,且低浓度的胰蛋白酶就可将mCherry从LCA2上有效地分离;荧光显微镜下观察到LCA2能将与之连接的mCherry运输到不同类型的细胞中,流式细胞仪检测到LCA2的运输能力具有一定的细胞差异性。共聚焦显微镜的荧光分析和Western印迹结果显示,LCA2载体将mCherry蛋白运送到内质网,Cs酶敏感位点被切开,模式蛋白质mCherry与LCA2分离并释放到细胞内。CCK-8结果表明,在给药剂量5~40μg/mL范围内,细胞增殖活力未见显著变化。上述结果证明,LCA2是一种安全有效的自释放型递送载体,能够将活性蛋白质或蛋白质药物运输到细胞内质网并释放。