摘要：目的:探讨趋化因子Fractalkine(FKN)联合肿瘤相关M2型巨噬细胞对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移等生物学功能的影响。方法:将含FKN基因序列的重组慢病毒HBLV-h-FKN-GFP-PURO感染人胰腺癌PANC-1细胞,同时用佛波酯及白细胞介素4序贯诱导人白血病单核细胞THP-1成为M2型巨噬细胞,然后通过Transwell小室系统建立胰腺癌细胞与M2型巨噬细胞非接触式共培养模型。共培养后收集胰腺癌细胞,采用CCK-8法检测PANC-1细胞的增殖情况,Transwell小室法和划痕愈合实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力。结果:HBLV-h-FKN-GFP-PURO感染人胰腺癌细胞PANC-1后,FKN蛋白表达水平较未感染对照组和空病毒感染组明显升高(P值均<0.001)。THP-1细胞经序贯诱导后成为高表达精氨酸酶Ⅰ(arginase-1,Arg-1)、低表达诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白的M2型巨噬细胞(PArg-1<0.001,PiNOS<0.01)。过表达FKN后,PANC-1细胞趋化共培养M2型巨噬细胞的能力明显增强(P <0.001)。FKN过表达后,PANC-1细胞的增殖、侵袭和迁移能力均增强(P值均<0.001);而与M2型巨噬细胞共培养后,PANC-1细胞的增殖、侵袭和迁移能力均更加显著地增强(P值均<0.01);依据析因设计资料的双向分组方差分析结果提示,FKN与M2型巨噬细胞之间存在交互作用(P增殖<0.01,P侵袭<0.01,P迁移<0.05)。结论:趋化因子FKN能促使人胰腺癌PANC-1细胞趋化募集M2型巨噬细胞。FKN和M2型巨噬细胞均可增强PANC-1细胞的增殖、侵袭和迁移能力,且二者之间具有交互协同作用。

摘要：目的利用小片段干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制S100A6蛋白的表达,为研究CacyBP/SIP核转位机制提供有利的工具。方法设计S100A6的siRNA序列,用脂质体LipofectamineTM 2000将siRNA转染至人结肠癌SW480细胞中,在荧光显微镜下观察转染效率,用Real-time PCR及Western blot方法检测S100A6在人结肠癌SW480细胞内的mRNA和蛋白表达。结果构建了3对S100A6-siRNA,荧光显微镜下检测转染人结肠癌SW480细胞成功;RT-PCR证明了在SW480细胞内S100A6的mRNA表达显著降低(P<0.05);Western blot证明了SW480细胞内S100A6蛋白表达显著降低(P<0.05);与S100A6si-1、S100A6si-3组相比,S100A6si-2组对S100A6的mRNA和蛋白抑制效果最明显(P<0.05)。结论成功构建了S100A6-siRNA,为CacyBP/SIP核转位机制研究提供了有利的工具。

摘要：目的构建编码人钙周期素结合蛋白(hCacyBP)基因的亚细胞定位载体并进行序列测定。方法 hCacyBP的模板来自人结肠癌细胞株HCT-116的cDNA序列,根据hCacyBP基因序列设计合成引物,采用PCR方法扩增编码hCacyBP的基因片段;将hCacyBP基因定向克隆到亚细胞定位载体pCMV/myc系列:pCMV/myc/nuc(胞核定位载体)、pCMV/myc/cyto(胞质定位载体)。转化*** DH5α感受态细胞,在氨苄青霉素阳性LB培养基平板上筛选出阳性克隆。重组质粒经PCR及双酶切鉴定并进行序列测定。结果从HCT-116的cDNA模板扩增684 bp的hCacyBP基因片段,分别构建重组质粒pCMV/myc/nuc-hCacyBP、pCMV/myc/cyto-hCacyBP,PCR及双酶切鉴定产物大小与预期值相符合,测序分析进一步表明所克隆的基因为编码hCacyBP的基因片段。结论成功构建hCacyBP基因亚细胞定位载体,这将为研究结肠癌胞核、胞质内的hCacyBP功能和研究该基因异常高表达与结肠癌发生发展的关系奠定实验基础。

摘要：目的用前列腺素E2刺激结肠癌细胞,观察和探讨可否引起CacyBP/SIP核转位。方法根据hCacyBP/SIP序列设计引物,PCR扩增、酶切、连接、转化等分子克隆法构建含有钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)的慢病毒重组质粒,PCR鉴定、测序;将构建好的带有绿荧光蛋白的CacyBP-Lentivirus载体转染至结肠癌SW480细胞,用激光共聚焦显微镜检测CacyBP/SIP表达定位;前列腺素E2刺激后激光共聚焦显微镜、Western blot观察CacyBP/SIP在细胞中的定位。结果激光共聚焦和Westernblot发现:前列腺素E2刺激前CacyBP/SIP定位和表达主要在细胞胞质,用100μmol/L前列腺素E2刺激1h,CacyBP/SIP定位和表达在细胞胞质和胞核。结论前列腺素E2刺激可以引起CacyBP/SIP由胞质转位至细胞核。

摘要：目的评估安奈拉唑钠40、60 mg对比雷贝拉唑钠20 mg治疗反流性食管炎(RE)的有效性和安全性。方法本项Ⅱ期临床研究采用多中心、随机、双盲和阳性药物平行对照设计。由海军军医大学第一附属医院(上海长海医院)牵头,南昌大学第一附属医院、宜春市人民医院、梅河口市中心医院、赣南医科大学第一附属医院、金华市中心医院等24家国内临床试验机构参与研究。经筛选入组156例RE(洛杉矶分级A~D级)患者,根据随机数字表法按照1∶1∶1比例随机分为安奈拉唑钠40 mg组、安奈拉唑钠60 mg组和雷贝拉唑钠20 mg组。以上3组患者服用相应的试验用药(1次/d),连续治疗4周或8周,采用盲态独立中心阅片与研究者阅片的方法评估各组患者的内镜下治愈率。此外,各单项症状(日间反流、日间烧心、夜间反流、夜间烧心)严重程度评分的改善情况和药物安全性也作为评价指标。按组别计算治疗8周和4周后的内镜下治愈率及其95%置信区间(95%CI),以及试验组与对照组间治愈率差值及其95%CI。采用卡方检验进行统计学分析。结果共153例受试者进入全分析集,144例进入符合方案集(PPS),151例进入安全性分析集(SS)。全分析集中,治疗8周后,安奈拉唑钠40 mg组、安奈拉唑钠60 mg组和雷贝拉唑钠20 mg组盲态独立中心阅片评估的内镜下治愈率分别为86.0%(43/50)、86.5%(45/52)和86.3%(44/51),95%CI分别为76.4%~95.6%、77.3%~95.8%、76.8%~95.7%;研究者阅片评估的治愈率分别为88.0%(44/50)、90.4%(47/52)和86.3%(44/51),95%CI分别为79.0%~97.0%、82.4%~98.4%、76.8%~95.7%;各组治愈率相当。全分析集中,盲态独立中心阅片和研究者评估的安奈拉唑钠40 mg组、安奈拉唑钠60 mg组与雷贝拉唑钠20 mg组治愈率差值(95%CI)分别为-0.3%(-13.7%~13.2%)、0.6%(-12.3%~13.6%)和1.7%(-11.3%~14.8%)、3.9%(-8.5%~16.3%)。PPS结果与全分析集结果趋势一致。治疗8周后,各组单项症状(日间反流、日间烧心、夜间反流、夜间烧心)的严重程度评分均降低,安奈拉唑钠40 mg组、安奈拉唑钠60 mg组、雷贝拉唑钠20 mg组与基线值差值分别为(-1.54±1.00)、(-1.91±1.00)、(-1.51±0.76)、(-1.45±0.71)分,(-1.30±0.94)、(-1.59±0.96)、(-1.33±0.65)、(-1.42±0.60)分,(-1.74±0.85)、(-1.76±0.93)、(-1.45±0.66)、(-1.66±0.79)分。安奈拉唑钠40 mg组、安奈拉唑钠60 mg组、雷贝拉唑钠20 mg组治疗期间不良事件发生率分别为57.1%(28/49)、48.1%(25/52)和60.0%(30/50),与试验用药相关不良事件发生率分别为18.4%(9/49)、25.0%(13/52)和24.0%(12/50),3组治疗期间不良事件和试验用药相关不良事件发生率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论安奈拉唑钠40、60 mg/d与雷贝拉唑钠20 mg/d治疗RE疗效和安全性相当。

摘要：目的构建整合素α5基因(ITGA5)的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定沉默ITGA5表达的肝癌细胞系Bel-7404。方法设计3条ITGA5基因特异性shRNA靶序列和1条非特异性序列作为阴性对照(NC),分别克隆到GV493质粒载体中,转化感受态细胞后挑取阳性克隆子进行DNA测序鉴定,包装成重组慢病毒,并纯化、测定病毒滴度。将4组慢病毒载体分别感染人肝癌细胞Bel-7404,使用嘌呤霉素筛选后,在荧光显微镜下观察GFP的表达,q PCR和Western blot分别检测各组中ITGA5的基因和蛋白质表达水平。结果 ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,q PCR和Western blot检测结果显示3种慢病毒干扰组的ITGA5表达水平均低于NC组(P均<0.05)。NC组m RNA的表达量为(100±2.3)%,ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组m RNA相对表达量分别为(10.7±3.7)%、(16.7±1.5)%、(11.8±2.9)%,且其干扰效率均达到70%以上,可选择其中一个干扰靶点进行后续实验。结论成功构建ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体,感染肝癌Bel-7404细胞并成功筛选出稳定沉默细胞系,为进一步研究ITGA5在肝癌中的生物学功能和作用机制提供了实验基础。