摘要：目的构建Mg^(2+)/Mn^(2+)依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定敲低PPM1A表达的BV2小鼠脑小胶质细胞系。方法针对PPM1A基因的编码序列(CDS)区,设计合成2对短发卡RNA(shRNA)序列shRNA1、shRNA2,分别将其克隆到GV493载体中,并转化至感受态大肠杆菌DH5α菌株,培养后挑取阳性克隆子进行测序,最后包装慢病毒并进行滴度测定。将2组慢病毒分别转染BV2小鼠脑小胶质细胞,并给予嘌呤霉素筛选,使用荧光显微镜及流式细胞术观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,评估转染结果,分别采用实时定量PCR和Western blot法检测PPM1A的mRNA和蛋白水平。结果 PPM1A基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,转染BV2小鼠脑小胶质细胞后GFP表达率大于80%;与对照组相比,shRNA1及shRNA2敲低组PPM1A mRNA及蛋白水平均显著降低。结论利用慢病毒shRNA方法成功构建PPM1A敲低的BV2细胞系。

摘要：目的克隆布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25基因并构建荧光真核表达载体p EGFP-N1-omp25,检测其在大鼠脑内的表达。方法根据Genebank中omp25基因的核苷酸序列,设计并合成1对引物,以布鲁氏杆菌总基因组DNA为模板,进行PCR扩增得到omp25基因片段,并将omp25基因片段及质粒p EGFP-N1分别进行进行酶切、体外连接,使其定向重组,构建其重组质粒。将制备的重组质粒经侧脑室注射至大鼠,检测p EGFP-N1-omp25在大鼠脑内的表达。结果 PCR扩增出642bp大小的片段,挑取的LB固体培养基上的单菌落经菌液PCR、酶切、测序表明成功构建了p EGFP-N1-omp25荧光真核表达载体。质粒经大鼠侧脑室注射后,脑组织冰冻切片可见荧光表达。结论采用体外重组技术,成功构建了布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25基因的真核表达载体,且重组质粒在大鼠脑组织内成功表达。