摘要：目的 探讨3D打印技术在颈椎管内、外哑铃形肿瘤手术中的应用.方法 前瞻性纳入2016年6月至12月宁夏医科大学总医院神经外科收治的5例颈椎管内、外哑铃形肿瘤患者,均采用后正中入路切除肿瘤.术前5例患者行CT血管造影及MRI检查,将原始影像学数据导入医用手术设计软件Mimics 17.0中进行重建,利用3D打印机建立3D打印模型,利用该模型制定手术方案并模拟手术,以指导手术治疗.结果 重建的二维图像和3D打印模型均能准确显示肿瘤与其周围血管、神经、椎体之间的解剖关系,可为肿瘤的Toyama分型提供更直观的依据.肿瘤全切除3例,次全切除2例.无一例出现椎动脉损伤或神经功能障碍加重.术后未出现肌力下降、脑脊液漏、切口感染以及颈椎反曲畸形等并发症.结论 3D打印模型可全面、直观、精准地显示颈椎管内、外哑铃形肿瘤与其周围结构的解剖关系,有助于最大程度地切除肿瘤,减少术后并发症.

摘要：星形胶质细胞上调基因-1（astrocyte elevated gene-1,AEG-1）在多种肿瘤中过表达,参与肿瘤的形成、转移等过程。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除AEG-1基因并研究其在胶质瘤细胞转移过程中的作用。首先设计构建sgRNA/Cas9二合一表达载体并转染到人胶质瘤U251细胞中,通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性;然后筛选建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,并利用Western blot实验检测AEG-1的敲除效率;最后利用Transwell小室、划痕实验评价AEG-1敲除后对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果显示,成功构建靶向敲除AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体,所构建的载体与实验设计相一致,通过TA克隆测序鉴定sgRNA有活性;成功建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,Western blot实验结果表明敲除效率高达98%; Transwell小室实验、划痕实验结果表明AEG-1敲除U251细胞系的转移能力明显降低。

摘要：目的研制化脓性脑膜炎常见细菌检测基因芯片,为化脓性脑膜炎病原学明确诊断提供新技术。方法在设计化脓性脑膜炎常见细菌:脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、其他凝固酶阴性葡萄球菌的特异性探针的基础上,通过芯片基片的制备、点样、固定、样品扩增标记、杂交及扫描等工艺过程的优化,完成基因芯片研制。结果初步研制出常见化脓性脑膜炎病原菌检测的基因芯片。结论研究的基因芯片能够用于化脓性脑膜炎常见病原菌的诊断和分型检测,有望成为一种化脓性脑膜炎脑脊液常见病原菌的高效检测技术。

摘要：星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)是近年来研究较多的癌基因,但在神经系统疾病方面研究尚少。AEG-1与神经退行性疾病有关,然而其具体作用机制尚不明确。本研究通过设计靶向AEG-1 sgRNA序列并合成相应寡核苷酸,将其克隆到GV392质粒中,构建sgRNA/Cas9二合一表达载体,并进行慢病毒包装纯化。用慢病毒感染小鼠海马神经元HT22细胞,进行药物筛选和sgRNA活性鉴定,建立稳定的AEG-1基因敲除的细胞系;并进一步观察神经元HT22细胞的增殖与凋亡能力。结果显示,成功构建了3种靶向AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体。所设计的sgRNA的插入序列和开放阅读框架完全正确,成功建立了AEG-1基因敲除的稳转神经细胞系。进一步研究表明,AEG-1敲除后的神经HT22细胞与正常神经HT22细胞相比,细胞突起数目减少,细胞周期阻滞,细胞凋亡率减少。以上结果为后续进一步研究AEG-1与神经系统疾病关系奠定了基础。

摘要：目的利用分子克隆技术构建大鼠AEG-1慢病毒表达载体并进行慢病毒包装。方法设计合成全长大鼠AEG-1基因序列(R-AEG-1),在克隆质粒GV367的基础上构建AEG-1基因慢病毒表达载体(R-AEG-1-GV367),测序鉴定构建成功。R-AEG-1-GV367与包装质粒转染293T细胞进行慢病毒包装。结果成功构建大鼠AEG-1慢病毒表达载体并成功包装出高效感染率的慢病毒颗粒,测定病毒滴度为2E+8TU·m^(-1)。结论 AEG-1慢病毒表达载体的构建及病毒颗粒包装为后续AEG-1过表达在神经细胞行为学和分子生物学的研究奠定了基础。

摘要：环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP responsive element-binding protein,CREB)是重要的核转录因子,有研究表明,在阿尔茨海默病患者中,CREB的表达降低,但CREB对于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的作用机制尚不清楚。该研究通过设计sg RNA序列并合成相应的寡核苷酸,将其克隆到p X459质粒中,构建CREB基因敲除的CRISPR/Cas9二合一表达载体。将构建成功的载体转染到HT22细胞中,通过TA克隆测序和T7E1酶切分析来验证sg RNA的活性。将构建的载体转染到HT22细胞中,用嘌呤霉素进行药物筛选,构建稳定的CREB基因敲除的细胞系。CREB对APP基因表达的调控作用通过检测其在正常HT22细胞和CREB基因敲除的HT22细胞系中的表达情况来进行确认。结果显示,成功构建了CRISPR/Cas9技术对CREB基因进行敲除的二合一表达载体,所设计的sg RNA的插入序列和开放阅读框架完全正确,经过酶切分析和序列测定,所构建的载体与实验设计相一致。CREB基因敲除的HT22细胞系其敲除效率达到90%以上。通过Western blot分析检测CREB对APP表达的影响,结果发现,当CREB基因敲除后,APP表达增加,而过表达CREB时,则APP蛋白质表达水平下降。这提示,CREB对APP的表达有下调作用,具体的机制还将继续研究。

摘要：目的通过生物信息学软件评价幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶多表位疫苗CTB-UE的抗原结构,并在***中表达、纯化融合蛋白CTB-UE。方法应用生物信息学软件DNAstar、Geno3D、MOE分析Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE的二级结构和三级结构;将人工合成的尿素酶多表位肽基因UE插入含CTB基因的重组质粒p ETC中,构建重组表达质粒p ETCUE,转化*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化重组蛋白CTB-UE,并进行Western blot分析。结果生物信息学软件分析显示,Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE具有合理的结构;重组表达质粒p ETCUE经双酶切和测序鉴定证实,融合基因CTB-UE与设计序列完全一致;表达的融合蛋白CTB-UE相对分子质量约为33 000,主要以包涵体形式表达,表达量占全菌蛋白的22.3%;纯化的融合蛋白CTB-UE纯度达95.6%,可与兔抗Hp多克隆抗体发生特异性结合。结论设计的Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE具有合理的结构,能在***中高效表达,纯化后纯度较高,且具有较强的反应原性,为进一步研究针对尿素酶A、B双亚基的Hp多表位疫苗奠定了基础。

摘要：目的构建Mg^(2+)/Mn^(2+)依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定敲低PPM1A表达的BV2小鼠脑小胶质细胞系。方法针对PPM1A基因的编码序列(CDS)区,设计合成2对短发卡RNA(shRNA)序列shRNA1、shRNA2,分别将其克隆到GV493载体中,并转化至感受态大肠杆菌DH5α菌株,培养后挑取阳性克隆子进行测序,最后包装慢病毒并进行滴度测定。将2组慢病毒分别转染BV2小鼠脑小胶质细胞,并给予嘌呤霉素筛选,使用荧光显微镜及流式细胞术观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,评估转染结果,分别采用实时定量PCR和Western blot法检测PPM1A的mRNA和蛋白水平。结果 PPM1A基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,转染BV2小鼠脑小胶质细胞后GFP表达率大于80%;与对照组相比,shRNA1及shRNA2敲低组PPM1A mRNA及蛋白水平均显著降低。结论利用慢病毒shRNA方法成功构建PPM1A敲低的BV2细胞系。

摘要：人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sg RNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在p Sp Cas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上,从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPR/Cas9质粒,将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定,将经过鉴定证实相位正确及在有sg RNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系。通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测Purα基因的表达情况,从而来判定Purα基因的敲除效率;将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲(HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。实验结果证实,所插入片段相位正确。通过TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可导致基因组碱基发生突变,Real-time PCR和Western blot实验结果证实,Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低。Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感,说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用,是细胞中一种不可或缺的蛋白质。该实验结果还提示,利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除,同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因,利用这一特点,可以方便地建立稳定的细胞系,该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。

摘要：目的:构建pcDNA3.1(+)磷脂酞肌醇蛋白5(gpc-5)基因真核表达载体。方法:根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区(CDS),连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果:gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1(+)gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。