摘要：目的探讨甘草酸二铵对严重烫伤大鼠肝损伤的影响及其机制。方法采用实验研究方法。取54只7~9周龄雌性SD大鼠,按随机数字表法分为背部模拟致伤的假伤组及背部造成30%体表总面积Ⅲ度烫伤的单纯烫伤组及烫伤+甘草酸二铵组,每组18只。假伤组伤后不行特殊处理;单纯烫伤组及烫伤+甘草酸二铵组大鼠进行补液抗休克,烫伤+甘草酸二铵组大鼠分别于伤后1、25、49 h经腹腔注射50 mg/kg甘草酸二铵溶液。取3组大鼠,伤后24、48、72 h,采用全自动生化检测分析仪检测血清肝功能损伤相关指标天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白、白蛋白含量,采用酶联免疫吸附测定法检测血清鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OCT)含量;行苏木精-伊红染色观察伤后72 h肝组织病理学变化;采用实时荧光定量反转录PCR法检测伤后24、48、72 h肝组织B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录激活因子4(ATF4)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)的mRNA表达。采用蛋白质印迹法检测假伤组伤后72 h及烫伤2组伤后24、48、72 h肝组织Bcl-2、Bax、GRP78、PERK、ATF4的蛋白表达。各组各时间点样本数均为6。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析及Bonferroni检验。结果与假伤组比较,单纯烫伤组大鼠伤后各时间点血清中AST、ALT、LDH含量均明显升高(P<0.01),总蛋白、白蛋白含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)。相较于单纯烫伤组,烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后24 h血清中AST含量明显下降(P<0.05);烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后48 h血清中AST、ALT、LDH含量均明显下降(P<0.01),总蛋白含量明显升高(P<0.01);烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后72 h血清中AST、ALT、LDH含量均明显下降(P<0.01),总蛋白和白蛋白含量均明显升高(P<0.01)。伤后24、48、72 h,单纯烫伤组大鼠血清OCT含量分别为(48.5±3.9)、(40.8±2.4)、(38.7±2.0)U/L,均明显高于假伤组的(15.1±2.5)、(15.7±2.6)、(16.4±3.7)U/L(P<0.01)和烫伤+甘草酸二铵组的(39.0±4.5)、(31.8±2.0)、(22.1±2.6)U/L(P<0.05或P<0.01)。伤后72 h,假伤组大鼠肝组织中细胞形态正常,排列规则,未见明显炎症细胞浸润;单纯烫伤组大鼠肝组织中细胞排列紊乱,伴有弥漫性的脂肪病变和中等量炎症细胞浸润;烫伤+甘草酸二铵组大鼠肝组织中细胞排列较规则,可见散在的脂肪变性,伴有少量炎症细胞浸润。与假伤组比较,单纯烫伤组大鼠伤后24、48、72 h肝组织Bcl-2 mRNA(P<0.05或P<0.01)和蛋白表达均明显减少,Bax的mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显增加。与单纯烫伤组比较,烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后48 h肝组织Bax的mRNA(P<0.05)和蛋白表达均明显减少;烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后72 h肝组织Bax的mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显减少,Bcl-2的mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显增加。与假伤组比较,单纯烫伤组大鼠伤后各时间点肝组织ATF4、GRP78、PERK的mRNA(P<0.05或P<0.01)和蛋白表达均明显增加。与单纯烫伤组相比,烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后48 h肝组织ATF4的mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显减少,伤后72 h肝组织ATF4、GRP78、PERK的mRNA(P<0.05或P<0.01)和蛋白表达均明显减少。结论甘草酸二铵能有效降低严重烫伤后大鼠肝损伤的程度,其机制可能是通过缓解内质网应激及减轻线粒体损伤。

摘要：目的观察早期补充外源性肉碱对严重烫伤大鼠肝脏线粒体损伤的影响并探讨其病理机制。方法取72只成年雌性SD大鼠，按照随机数字表法分为假伤组、烫伤组、烫伤＋肉碱组，每组24只。假伤组大鼠背部浸入37 ℃水浴锅中12 s模拟致伤，伤后不补液。烫伤组和烫伤＋肉碱组大鼠背部浸入98 ℃水浴锅中12 s造成30%体表总面积（TBSA）Ⅲ度烫伤，伤后立即按照Parkland补液公式经尾静脉注射乳酸钠林格液4 mL·kg－1·%TBSA－1。烫伤＋肉碱组大鼠同时于伤后1 h开始，经尾静脉注射左旋肉碱溶液300 mg·kg－1·d－1。伤后12、24、48、72 h，各组分别取6只大鼠收集腹主动脉血及肝组织，采用ELISA法检测血清中肉碱、β羟丁酸、鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OCT）含量，全自动生化检测分析仪测定血清乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）的含量，行大鼠肝脏组织形态学观察。对数据行析因方差分析、SNK检验或Tamhane检验、Bonferroni校正。结果（1）烫伤组大鼠伤后各时间点血清肉碱含量明显低于假伤组（P〈0.05），烫伤＋肉碱组大鼠伤后12、24、48 h血清肉碱含量明显低于假伤组（P〈0.05），伤后72 h烫伤＋肉碱组[（28.2±3.0）μg/mL]大鼠血清肉碱含量与假伤组[（29.4±4.0）μg/mL]相近（P〉0.05）。烫伤＋肉碱组大鼠伤后各时间点血清肉碱含量明显高于烫伤组（P〈0.05）。（2）烫伤组与烫伤＋肉碱组大鼠伤后各时间点血清β羟丁酸含量明显低于假伤组（P〈0.05），2组大鼠血清β羟丁酸含量均呈现上升趋势，于伤后72 h达峰值，分别为（1.77±0.30）、（2.93±0.44）mmol/L。烫伤＋肉碱组大鼠伤后各时间点血清β羟丁酸含量明显高于烫伤组（P〈0.05）。（3）烫伤组与烫伤＋肉碱组大鼠伤后各时间点血清OCT含量明显高于假伤组（P〈0.05），2组大鼠血清OCT含量均呈现降低趋势，于伤后12 h达峰值，分别为（186.28±6.77）、（163.38±9.34）ng/mL。烫伤＋肉碱组大鼠伤后各时间点血清OCT含量明显低于烫伤组（P〈0.05）。（4）烫伤组大鼠伤后各时间点血清LDH含量明显高于假伤组（P〈0.05）。烫伤＋肉碱组大鼠伤后12、24 h血清LDH含量明显高于假伤组（P〈0.05），于伤后12 h达峰值[（2 226±274）U/L]；伤后48、72 h血清LDH含量与假伤组相近（P〉0.05）。烫伤＋肉碱组大鼠伤后各时间点血清LDH含量明显低于烫伤组（P〈0.05）。（5）烫伤组与烫伤＋肉碱组大鼠伤后各时间点血清ALT、AST含量明显高于假伤组（P〈0.05）。烫伤＋肉碱组大鼠伤后48、72 h血清ALT含量低于烫伤组（P〈0.05），伤后48 h血清AST含量低于烫伤组（P〈0.05），其余时间点与烫伤组相近（P〉0.05）。烫伤＋肉碱组大鼠血清ALT、AST含量均呈现降低趋势，于伤后12 h达到峰值，分别为（260±25）、（1 511±145）U/L。（6）伤后各时间点假伤组大鼠肝组织基本正常，烫伤＋肉碱组大鼠肝组织损伤程度均较烫伤组大鼠轻。其中，伤后72 h烫伤组大鼠肝组织可见明显胞质疏松、肝组织结构缺失伴弥漫性脂肪变性及大片凝固性坏死；烫伤＋肉碱组大鼠肝组织仅可见局部散在的脂肪变性。结论严重烫伤大鼠早期补充外源性肉碱，可使血清肉碱和β羟丁酸含量更快恢复到正常水平，减轻肝细胞线粒体损伤，维持严重烫伤早期肝细胞的代谢稳定。

摘要：目的利用RNA干扰技术建立稳定敲低OPTN蛋白的人SKOV3细胞株和利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立稳定敲除OPTN蛋白的人SKOV3细胞株,并研究降低OPTN基因表达对细胞抗癌药物敏感性的影响。方法针对OPTN基因设计shRNA和sgRNA的序列,并与慢病毒载体质粒pGPU 6_GFP_Neo和敲除质粒PX 459载体连接产生重组载体。并将重组的质粒测序验证,将测序成功的重组质粒载体与包装质粒(psPAX 2、pMD 2.G)共转染293 T细胞进行病毒包装,收集病毒上清液并感染SKOV3细胞,获得稳定敲低和稳定敲除OPTN基因的SKOV3细胞株。RT-PCR检测敲低组OPTN基因的表达的变化,PCR检测敲除组的基因组DNA的变化,Western blot法分析检测OPTN蛋白的表达情况。MTT法检测DDP对卵巢癌细胞增殖的影响,qRT-PCR检测caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA的表达情况,Western blot检测caspase3、Bax、和Bcl-2蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒载体和基因敲除载体,在SKOV3细胞中的OPTN蛋白表达降低(敲减细胞株)或完全敲除(敲除细胞株)。OPTN基因被敲减和敲除的卵巢癌细胞(SKOV3)对顺铂(DDP)的敏感性降低;与对照组相比,DDP对细胞抑制率降低(P<0.05,P<0.01),基因敲除的细胞效果更好。通过qRT-PCR和Western blot检测稳定敲减和敲除OPTN蛋白的SKOV3细胞其凋亡相关基因caspase3、Bax的mRNA和蛋白的表达量降低,而Bcl-2的表达量上升(P<0.05,P<0.01)。结论在卵巢癌中降低或去除OPTN基因表达,能够降低卵巢癌细胞对抗癌药物DDP的敏感性,OPTN可能通过影响凋亡相关途径实现的。

摘要：目的构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程。方法根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-C1/LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加。结论成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成。

摘要：目的构建弓形虫Chinese 1基因型Tg Ct Wh3(以后均简称Wh3)株棒状体蛋白(rhoptry protein,ROPs)16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至p MD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3D结构。结果各组均PCR扩增出约2.1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以p ET-28a和p EGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。