摘要：目的 建立检测重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85b蛋白原液纯度的反向高效液相色谱法,并进行验证。方法 设计4因素3水平正交试验,将面积、拖尾因子、峰面积、峰面积RSD作为评价指标进行分析,摸索最适检测条件,并依据《中国药典》四部(2020版)9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行专属性、线性范围、精密度、耐用性等验证。结果 当检测条件为有机相洗脱比例30%~95%、检测温度35℃、进样量3μg、95%有机相洗脱时间15 min时,各评价指标结果均较好,在该检测条件下线性相关系数(R2)为0.998 5,线性范围为1.8~4.2μg;重复性RSD为0.01%;中间精密度RSD为0.16%;在柱温与流速细微变动下均具有良好的耐用性。结论 建立了重组MTBAg85b蛋白原液纯度检测的反向高效液相色谱法,该方法专属性强,精密度、耐用性好,可用于重组MTBAg85b蛋白原液质量控制。