摘要：为建立快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-I)血清型通用PCR方法,根据FAdV-Ⅰ12个血清型基因保守区设计引物,建立了二温式PCR和VPCR方法。结果显示:本研究建立的FAdV-Ⅰ二温式PCR方法,在90℃~94℃变性3 s、70℃~74℃退火兼延伸8 s,循环35~40次时,最快可在15 min内完成扩增;对分属5个种的5个血清型毒株检测都呈阳性,对EDSV、NDV、沙门菌等12种禽常见病原核酸检测呈阴性;最低检测质粒拷贝数为13.9 copies/μL,最低检测病毒滴度为100.3 EID50/0.1 mL;对源于FAdV-4感染致死SPF鸡的心脏、肝脏、脾脏等14种样品核酸提取物检测均为阳性。建立的VPCR,在92℃变性0 s、70℃退火延伸0 s,40次循环时,可23 min完成,其最低检测质粒拷贝数亦为13.9 copies/μL;对150份采集自安徽省部分地区样品及送检病料的检测与分析显示,所建立的二温式PCR和VPCR总阳性检出均率为30.7%,其符合率为100%。本研究表明,所建立的通用型二温式PCR和VPCR方法,均可用于Ⅰ群FAdV的快速检测与鉴定。

摘要：目的:建立快速、灵敏、特异的基因2型鹅星状病毒(Goose astrovirus 2,GoAstV-2)检测方法。方法:以GoAstV-2 ORF2基因为靶标,设计特异性检测引物并构建含目标基因的重组质粒作为阳性质粒标准品,以其为模板优化建立一种EvaGreen饱和染料荧光定量一步法RT-PCR检测方法。结果:所建立方法采用dUTP/UDG酶防污染体系,其标准曲线在2.58×10^(1)~2.58×10^(7) copies/μL质粒模板量呈现良好的线性关系,斜率为-3.413,相关系数(R^(2))为0.995,熔解温度T_(M)为(85.5±0.5)℃;该方法对质粒标准品检测灵敏度下限为25.8 copies/μL;该方法特异性检测GoAstV-2,而新城疫病毒(NDV)、H5型禽流感病毒(AIV-H5)、禽呼肠孤病毒(ARV)等11种常见禽传染病病原检测结果均为阴性。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于2%,表明其具有良好的重复性。GoAstV-2感染病死鹅组织定量检测显示,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、胰腺、小肠、大脑和肌肉组织均可检测出GoAstV-2,其中肾脏病毒含量最高(2.58×10^(11) copies/g),大脑和肌肉组织含毒量较低。32份临床送检病死鹅组织样品的检测显示,9份存在GoAstV-2感染,阳性率为28.1%。结论:EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR能高效检测GoAstV-2,可应用于禽类GoAstV-2感染的诊断和净化检测。

摘要：为建立快速诊断小鹅瘟的PCR方法,根据已发表的GPV主要结构蛋白VP3基因序列,经多序列比对和Oligo 6.0软件分析设计特异性PCR引物。以微量法提取病鹅肝组织DNA,优化PCR反应引物退火温度、循环次数和鉴定其特异性,并与酚氯仿法和煮沸法进行同步对比研究。结果显示,建立的PCR检测方法能够特异性检测病鹅肝组织中GPV的核酸,其扩增片段大小为343bp,最佳退火温度为58℃,最佳循环次数为35次。微量法提取的病毒核酸PCR检测灵敏度分别是酚氯仿法的50倍和煮沸法的2500倍。该PCR检测方法不与鹅副黏病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、鸭瘟病毒以及健康鹅肝组织发生交叉反应。本研究建立的GPV PCR检测方法能够快速诊断小鹅瘟。