摘要：目的:设计并构建含有前列腺组织特异性抗原(PSA)启动子的TAT-p21WAF1/CIP1融合蛋白真核表达载体(pPSA-TAT-p21),使由TAT蛋白转导结构域(TAT)介导的抑癌基因蛋白p21WAF1/CIP1(p21)能够在前列腺癌细胞中实现特异性的跨膜转运,增强p21对前列腺癌的抑制作用。方法:利用PCR技术构建含有PSA启动子、TAT蛋白转导序列和p21读码框架的真核表达载体pPSA-TAT-p21,并进行酶切、测序鉴定。脂质体法在前列腺癌LNCaP细胞和大肠癌HT-29细胞中转染上述表达载体及对照质粒后进行反转录PCR(RT-PCR),检测p21的mRNA以及蛋白在不同细胞中的表达情况。MTT法检测转染pPSA-TAT-p21后LNCaP细胞的增殖情况。结果:成功构建pPSA-TAT-p21真核表达载体。RT-PCR和Western blotting结果显示PSA-TAT-p21在前列腺癌细胞中有明显表达,在大肠癌细胞中基本不表达,呈现特异性的表达,而由CMV启动子介导的p21(pCMV-21)对照组在两个细胞株中均有表达。细胞增殖实验结果显示,含有TAT蛋白转导结构域的PSA-TAT-p21的融合蛋白对前列腺癌细胞增殖的抑制作用明显高于不含TAT的PSA-p21蛋白。结论:pPSA-TAT-p21能够在前列腺癌细胞中特异性地高效表达,为前列腺癌基因的靶向治疗提供了实验依据。

摘要：目的:根据鞘脂激活蛋白原神经营养序列设计并构建短肽(neurotrophic peptide,NP)多拷贝串连表达载体,利用基因工程的方法制备短肽NP。方法:根据大肠杆菌的偏爱密码子设计并合成NP的碱基片段,通过PCR方法合成串联双拷贝2NP片段,经平端连接克隆到载体pUC18中。利用EcoT14I酶切pUC18-2NP后可产生非镜相对称黏性末端,与表达载体pETEcoT一次连接反应,得到一系列含有不同片段拷贝数的表达载体pETE-coT-multiNP,经PCR-array方法进行阳性克隆筛选、测序鉴定后转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达。结果:经IPTG诱导后,在BL21(DE3)菌中高效表达了2、4、8拷贝融合蛋白,并在每个单拷贝之间加入了溴化氢的切割位点,使融合蛋白切割后能够得到单拷贝的短肽。结论:短肽NP在大肠杆菌中获得高效表达,为进一步研究其生物活性奠定了基础。

摘要：目的构建由前列腺特异抗原(PSA)启动子介导、表达带有蛋白转导结构域序列(TAT)的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白pPSA-TAT-EGFP表达载体,使TAT所携带的目的蛋白能够在靶组织中高效表达,提高其特异性及表达效率。方法以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,PCR技术扩增含有酶切位点的小片段SalI-TAT-EGFP-Not I,经胶回收纯化,连接到T克隆载体。双酶切及测序鉴定后,提取质粒、双酶切后胶回收得到目的小片段。含有PSA启动子的pPSA-EGFP载体经Sal I和Not I双酶切后,胶回收含有PSA启动子序列的大片段。过夜连接目的小片段与PSA启动子大片段,得到pPSA-TAT-EGFP表达载体。转化、筛选阳性克隆后酶切与测序鉴定。将构建载体分别转染前列腺癌细胞和大肠癌细胞检测其表达情况。结果成功构建pPSA-TAT-EGFP表达载体。转染结果显示其能够在前列腺癌细胞中特异性表达。结论引入了PSA组织特异性启动子的TAT所携带的目的蛋白能够在前列腺癌组织中表达。

摘要：目的构建靶向多药耐药基因(MDR-1)的短发夹RNA(short hairpin loop RNA shRNA)干扰表达质粒,并探讨其逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的作用效果。方法根据MDR-1基因表达序列设计有效的RNA干扰片断,构建并获得MDR-1基因特异的shRNA质粒表达载体pRNAT-U6.1/Neo-mdr1,采用lipofectin2000分别转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR,利用G418筛选稳定表达的细胞克隆。利用RT-PCR检测MDR-1-RNA的表达,WesternBlotting检测MDR-1蛋白质的表达,MTT法检测耐药逆转效果,罗丹明123外排实验检测p-gp的转运功能。结果成功构建表达siRNA的质粒载体pRNAT-U6.1/Neo-mdr1,转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR后48 h及G418筛选后1、2月,mdr1-RNA及蛋白质表达均呈明显下降,p-gp的转运功能明显提高,对阿霉素的敏感性增强,与耐药细胞及转入空白载体的细胞比较,差异有统计学意义(P均0.05)。结论shRNA干扰表达质粒pRNAT-U6.1/Neo-mdr1能够稳定、持久的抑制MDR-1基因,逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADR对阿霉素的耐药性。

摘要：目的:探讨靶向多药耐药基因(MDR-1)的siRNA和asODN联合应用逆转人白血病耐药细胞K562/A02的效果。方法:设计并合成针对MDR-1基因同一序列的siRNA和asODN及阴性对照siRNA,采用转染试剂lipofectin2 000分别转染人白血病耐药细胞K562/A02;利用RT-PCR检测MDR-1mRNA和Western Blot检测MDR-1蛋白质的表达;采用罗丹明123外排实验检测P-糖蛋白(P-gp)的转运功能,MTT法检测K562/A02细胞对阿霉素的耐药逆转效果。结果:siRNA、asODNa、sODN和siRNA联合应用均能降低MDR-1mRNA和蛋白质的表达,提高P-gp的转运功能,对阿霉素的敏感性明显恢复,asODN和siRNA联合应用效果明显提高(P<0.05),低浓度的siRNA(200 nmol/L)比高浓度的asODN(5μmol/L)的效果强(P<0.05)。结论:siRNA、asODN能有效地逆转人白血病耐药细胞K562/A02的多药耐药,asODN和siRNA联合应用效果明显加强。

摘要：目的:构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的RNAi慢病毒载体。方法:根据ODC mRNA序列, 选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链,退火后插入pSuper载体的H1RNA启动子后产生pRiODC,将其中的ODC shRNA表达结构酶切插入慢病毒转移质粒pHR' CMVGFP,产生pHRiODC/GFP。与△R8.2和pCMVVSVG共转染HEK293T细胞,包装产生慢病毒,分别采用转导HEK293T细胞和Real-Time RT-PCR的方法测定慢病毒的功能滴度和病毒RNA分子拷贝数。结果:酶切和测序证实,pRiODC质粒构建正确,产生能同时表达GFP和转录产生ODC shRNA的慢病毒转移质粒PHRiODC/GFP,未浓缩及浓缩病毒悬液的功能滴度分别为6.3×104 TU/ml和7×106TU/ml, RNA拷贝数分别为3.4×108copies/ml和3.6×1010copies/ml。结论:成功构建人ODC基因RNAi慢病毒载体,为通过阻断ODC基因表达治疗恶性肿瘤奠定了基础。

摘要：目的检测人外周血单个核细胞(PBMC)与肝细胞Na+-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)基因的表达情况,探讨HBV感染PBMC的可能途径,研究乙型肝炎病毒(HBV)感染PBMC机制。方法用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞,用TRIzol提取人外周血单个核细胞与肝细胞总RNA,经逆转录合成cDNA。设计合成一对针对NTCPmRNA的特异性引物,对人外周血单个核细胞及肝细胞的cDNA进行PCR扩增,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,以检测NTCP基因在两种细胞的表达情况。结果 RT-PCR电泳显示,用NTCP基因特异性引物对肝细胞cDNA扩增,扩增产物大小在200~300bp之间,与NTCP基因理论值(246bp)相符,即肝细胞NTCP基因表达阳性;人外周血单个核细胞的cDNA扩增后进行电泳鉴定,未出现特异性条带,即NTCP基因表达阴性。结论人外周血单个核细胞不表达NTCP基因,提示其表面的HBV受体可能并非NTCP,或HBV循非受体途径进入PBMC,关于HBV感染PBMC的具体机制尚需进一步研究。