摘要：目的观察葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase，GCS）靶向的微小RNA（microRNA）表达载体对乳腺癌细胞GCS表达的抑制作用及乳腺癌细胞药物敏感性的作用。方法以GCS为靶基因，设计并构建2个针对GCS不同位点的microRNA表达载体，脂质体转染MCF-7／ADR细胞，RT-PCR和Western印迹检测转染前后GCSmRNA和GCS蛋白的表达，MTT法检测细胞对阿霉素和长春新碱的药物敏感性。结果2个microRNA重组载体转染后，MCF-7／ADR细胞中GCSmRNA的表达水平分别为0．098±0．005和0．143±0．007，与对照组（0．875±0．008）相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。GCS蛋白的表达水平（0．127±0．004、0．165±0．008）较对照组细胞（0．765±0．007）明显降低（P〈0．01）。另外，转染后的MCF-7／ADR细胞对阿霉素的耐药倍数分别为4．06、6．06。对于长春新碱的耐药倍数分别为8．30、12．67。与对照组相比耐药倍数显著下降（P〈0．01）。结论GCS靶向的外源性microRNA能明显抑制GCS基因表达，并显著提高乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，为提高乳腺癌的化疗效果提供了新的途径。

摘要：目的:构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的RNAi慢病毒载体。方法:根据ODC mRNA序列, 选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链,退火后插入pSuper载体的H1RNA启动子后产生pRiODC,将其中的ODC shRNA表达结构酶切插入慢病毒转移质粒pHR' CMVGFP,产生pHRiODC/GFP。与△R8.2和pCMVVSVG共转染HEK293T细胞,包装产生慢病毒,分别采用转导HEK293T细胞和Real-Time RT-PCR的方法测定慢病毒的功能滴度和病毒RNA分子拷贝数。结果:酶切和测序证实,pRiODC质粒构建正确,产生能同时表达GFP和转录产生ODC shRNA的慢病毒转移质粒PHRiODC/GFP,未浓缩及浓缩病毒悬液的功能滴度分别为6.3×104 TU/ml和7×106TU/ml, RNA拷贝数分别为3.4×108copies/ml和3.6×1010copies/ml。结论:成功构建人ODC基因RNAi慢病毒载体,为通过阻断ODC基因表达治疗恶性肿瘤奠定了基础。

摘要：目的:建立表达乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的耐药细胞系MCF-7/BCRP。方法:提取MCF-7细胞的总RNA,设计BCRP基因上下游引物,用RT-PCR法克隆出BCRP基因全长并连接到真核表达载体pcDNA3.1穴-雪上,转染MCF-7细胞后以G418筛选细胞。采用米托蒽醌外排实验、细胞毒性实验、细胞群体倍增时间、免疫荧光法鉴定构建的耐药细胞系。结果:MCF-7/BCRP对米托蒽醌耐药指数增加至14.72;外排米托蒽醌的作用增强;细胞群体倍增时间较亲代细胞延长;MCF-7/BCRP细胞能表达一定量的BCRP。结论:MCF-7/BCRP细胞能够表达BCRP并具有BCRP的耐药表型。