摘要：目的:克隆人高迁移率族B1Abox(HMGB1 A box)基因,构建高效稳定的大肠杆菌(***)表达菌株,并探讨其对免疫复合物(IC)刺激单核细胞活化的抑制作用。方法:根据本室优化合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段并插入克隆载体pMD19-T,菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆。重组克隆载体经NdeⅠ和XhoⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,插入表达载体pQE-T7-2的相应位点,菌落PCR鉴定重组表达载体。重组菌株经IT-PG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定重组蛋白。Ni2+-NTA层析柱纯化重组人HMGB1 A box,RT-PCR检测其对IC刺激单核细胞活化的抑制作用。结果:获得重组人HMGB1 A box的表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。Western blot显示重组蛋白能与抗人HMGB1多克隆抗体和抗His-Tag多克隆抗体特异反应。目的蛋白纯度高达90%以上,并能有效抑制IC诱导单核细胞分泌BAFF、IFN-γ及TNF-α。结论:成功构建了重组人HMGB1 A Box的表达载体,纯化的重组蛋白能有效抑制IC刺激单核细胞活化后细胞因子的分泌。

摘要：目的构建大鼠CD。基因RNAi慢病毒载体。方法针对大鼠CD40基因RNAi设计有效靶序列，合成靶序列的寡核苷酸序列。退火形成双链DNA，与经Hpal和Xhol双酶切后的GV118载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。随后进行Westernblot外源筛选最佳干扰靶点、慢病毒包装及病毒滴度测定。结果CD40siRNA成功插入慢病毒载体。慢病毒载体经293T细胞包装成功，测定病毒的滴度为2．0×10^12TU／L。结论成功构建大鼠CD40基因的RNAi慢病毒载体，为后期进一步研究病毒性心肌炎发病机制及新的治疗方法提供工作基础。

摘要：目的制备人B淋巴细胞刺激因子-白喉毒素融合蛋白(hsBAFF-DT388),探讨其靶向B细胞活性。方法根据优化合成的hsBAFF-DT388基因序列设计引物,PCR扩增目的基因并插入克隆载体pMD19-T,采用菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆,重组克隆载体经双酶切后插入表达载体pColdⅡ,并鉴定重组表达载体。重组菌株经ITPG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,经Ni2+-NTA层析柱纯化,检测重组蛋白的生物学活性。结果获得hsBAFF-DT388高效表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。重组蛋白与BAFF受体阳性细胞特异性结合并对人B细胞系***具有靶向细胞毒作用。结论成功构建hsBAFF-DT388表达载体,获得具有靶向B细胞活性的重组蛋白,为其在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病治疗中的应用研究奠定基础。

摘要：目的　探讨TSH受体基因单核苷酸多态性 (SNP)与甲状腺疾病〔包括Graves病 (GD) ,结节性甲状腺肿 ,桥本甲状腺炎 (HT)〕有无相关性。方法　以 60例有甲状腺疾病家族史患者 (其中 3 0例GD、10例HT、2 0例结节性甲状腺肿患者 ) ,48例散发Graves病患者及 96名健康对照者作为研究对象 ,采用外周血白细胞抽提DNA ,设计引物 ,PCR扩增 ,对扩增产物纯化后测序。结果患者中共发现 8个多态位点 ,其中第8外显子上的多态位点 (E8A + 40C)在SNP库中未见报道 ,为首次发现 ;将这些多态位点基因型变化与正常组比较 ,无明显统计学差异。结论　本研究提示汉族人TSH受体基因与这几种甲状腺疾病无相关性 ;该基因的多态位点在不同的人种间存在明显差异。

摘要：目的检测人外周血单个核细胞(PBMC)与肝细胞Na+-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)基因的表达情况,探讨HBV感染PBMC的可能途径,研究乙型肝炎病毒(HBV)感染PBMC机制。方法用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞,用TRIzol提取人外周血单个核细胞与肝细胞总RNA,经逆转录合成cDNA。设计合成一对针对NTCPmRNA的特异性引物,对人外周血单个核细胞及肝细胞的cDNA进行PCR扩增,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,以检测NTCP基因在两种细胞的表达情况。结果 RT-PCR电泳显示,用NTCP基因特异性引物对肝细胞cDNA扩增,扩增产物大小在200~300bp之间,与NTCP基因理论值(246bp)相符,即肝细胞NTCP基因表达阳性;人外周血单个核细胞的cDNA扩增后进行电泳鉴定,未出现特异性条带,即NTCP基因表达阴性。结论人外周血单个核细胞不表达NTCP基因,提示其表面的HBV受体可能并非NTCP,或HBV循非受体途径进入PBMC,关于HBV感染PBMC的具体机制尚需进一步研究。