摘要：目的构建H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位肽的真核表达载体并检测其在293T细胞中的表达,并鉴定疫苗抗肿瘤效应。方法筛选鉴定H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位9肽,设计并合成肽疫苗核酸序列,插入p UC57载体,经酶切和测序鉴定,亚克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)及p EGFP-N1载体,转染293T细胞,RT-PCR鉴定目的基因的转录,共聚焦显微镜鉴定目的基因的表达。构建pc DNA3.1(+)-WT1免疫小鼠,取小鼠脾细胞进行体外特异CTL杀伤FBL3细胞试验。结果构建的基因疫苗经测序、双酶切及PCR鉴定确认无误;其携带的目的基因可在293T细胞中表达。免疫小鼠后特异CTL对FBL3杀伤结果高于对照组(P<0.05)。结论成功构建了H-2Kb限制性WT1蛋白CTL表位肽基因疫苗,载体疫苗能在真核细胞中成功表达,疫苗特异CTL具有体外杀伤肿瘤细胞功能,为提高WT1肽疫苗的抗肿瘤效应提供了新思路。

摘要：目的构建WT1(Wilms’tumor gene 1)蛋白CTL表位肽基因载体,并检测其在293T细胞中的转录。方法设计分别含WT1-126肽、WT1-235肽以及这两种肽的基因载体,并加入Th通用表位Pan-DR-Th(PADRE),应用蛋白酶体切割软件PAProC和NetChop优化各表位和间隔序列,DNA疫苗在线预测工具DyNAVacS优化真核密码子后,人工合成核苷酸序列,分别插入pUC57载体,构建pUC57-WT1质粒,测序鉴定后,酶切回收各目的片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒,转染293T细胞,RT-PCR检测各目的基因在293T细胞中的转录。采用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取各重组质粒,采用紫外分光光度计测定质粒的纯度和浓度。结果各重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证实构建正确;重组质粒携带的目的基因可在293T细胞中成功转录;各重组质粒DNA的纯度均合格,浓度在864.6～883.9μg/ml之间。结论成功构建了WT1蛋白CTL表位肽基因载体,并能在真核细胞中正常转录,为下一步在小鼠体内探讨特异性不同的CTLs群发挥抗肿瘤作用的机制奠定了基础。

摘要：免疫学教学在硕士研究生教育中对培养学生更高层次的创新思维和实践能力发挥重要的作用。改革现有的免疫学教学模式,以适应新形势下本门课程对硕士研究生培养的需求是当前医学硕士研究生教学亟待解决的问题。我们尝试进行了专业基础知识学习模块、前沿动态的研究性学习模块和实践性学习模块等模块化教学设计,引入翻转课堂、案例讨论教学等多元化手段并举的教学方式,经总结分析,学生们普遍对此种教学模式感到满意。

摘要：虚拟仿真实验是推进高等教育信息化建设的重要手段之一。本文旨在结合本校微生物教学内容构建病毒鸡胚接种医学虚拟仿真实验,弥补因生物安全性不能开展的实验教学。面对面“线下”教学过程中借鉴jigsaw拼图教学法,呈现以“学生为中心”的师生互动模式;同时设计考核细则,完善过程评价,以评促学。探索线上有资源、线下有活动、过程有评价的混合式教学模式,有效地提高学生基础实验技能和学习效果。同时融入课程思政理念,培育医学生职业使命感。

摘要：目的 PCBP1是真核细胞内的一种桥梁蛋白,具有多种生物学功能。本研究以慢病毒质粒构建PCBP1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,并筛选其稳定感染的神经细胞系,为进一步通过该载体系统探讨PCBP1的具体功能提供有力手段。方法设计合成针对人及小鼠的PCBP1基因的siRNA茎环结构的正反义序列,退火形成双链,与pLenti-Lox3.7载体的双酶切产物连接,以质粒PCR、酶切和DNA测序等方法,对重组克隆进行鉴定以确认目的片段的插入。之后,采用脂质体转染,将慢病毒载体系统的核心载体pLentiLox3.7和包装质粒共转染293T细胞,收获病毒颗粒,分别感染SH-SY5Y细胞,再通过流式分选获得感染不同病毒颗粒的细胞,提取RNA检测PCBP1 mRNA水平。结果检测结果显示PCBP1 siRNA茎环结构序列正确插入pLentiLox3.7载体,并且成功构建PCBP1基因敲低的神经细胞系。结论 PCBP1基因siRNA表达载体及其基因敲低稳定细胞系的成功构建,为进一步研究该基因在相应细胞中的功能奠定了基础。

摘要：SMU1是一个与细胞基因组复制和RNA剪切过程相关的新基因。该研究为进一步调查SMU1对细胞增殖及DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DNA DSBs)损伤应答的影响,设计合成针对SMU1基因的小分子siRNA,并与对照siRNA(scramble)分别转染HEK 293T或U2OS细胞。通过免疫印迹(Western blot)检测证实,siSMU1转染细胞中SMU1的表达显著下降,采用台盼蓝染色细胞计数检测显示,SMU1表达下调显著降低细胞增殖能力。免疫荧光和免疫印迹法检测结果表明,SMU1表达下调显著增加细胞内源性DSBs损伤(γH2AX foci和蛋白水平均升高);而进一步用X-ray处理细胞造成外源性DSBs损伤后,SMU1沉默细胞显示出延长的DSBs损伤修复动力学(减缓的γH2AX foci和蛋白水平消退)。以上结果提示,SMU1在细胞DSBs损伤修复反应中扮演重要角色,积极参与细胞基因组完整性的维持。

摘要：目的前期制备并鉴定了Tat-E7/pORF-mGM-CSF颗粒疫苗,并在小鼠体内观察到良好的抗肿瘤效果,但其体内具体分子机制不清。本研究拟进一步利用该疫苗免疫小鼠,分析其体内激活T细胞应答的分子机制。方法通过免疫组化检测该纳米颗粒能否将外源基因转入哺乳动物细胞并在动物活体内正确表达;通过CCK-8淋巴细胞增殖实验、细胞内染色及流式细胞术(FCM)、ELISPOT实验、体外特异性细胞毒CTL-LDH释放实验分析疫苗诱导的短期及记忆性免疫应答和其介导的CTL毒性效应。结果当r=2.0时所制备的颗粒为类圆形,大小均匀一致,绝大部分颗粒直径均分布于20~80 nm之间;该纳米颗粒可将mGM-CSF基因导入哺乳动物细胞,并可在体外培养细胞和小鼠体内正确表达。该纳米颗粒疫苗在体外和体内均很大程度上提高了抗原表位特异性的免疫原性,可诱导T淋巴细胞增殖、分化,显著增强抗原特异性CTL应答及其产生的细胞毒效应。结论我们在本研究中设计并合成的Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒疫苗,通过体外免疫学研究证实了其具有良好效果,其机制可能是该颗粒疫苗的免疫可以维持高水平的特异性CD8^+记忆T细胞。

摘要：目的通过正交实验优化异硫氰酸胍-硅胶提取细菌DNA的方法,以缩短其提取时间,进而缩短细菌特别是炭疽芽孢杆菌等恐怖细菌的核酸分子检测时间。方法以基因芯片的杂交信号值为指标,以异硫氰酸胍-硅胶提取DNA过程中的煮沸时间、室温放置时间、乙醇洗涤次数为考察因素通过正交实验法优化异硫氰酸胍-硅胶提取细菌DNA的条件。结果优化后的因素水平为煮沸10 min,室温放置15 min,乙醇洗涤2次。结论实验证明,优化后的提取时间比原来缩短了25 min,且信号值比原方法更高。

摘要：目的　探讨Helicobacterpylori(Hp)相关性胃炎中Hp密度、cagA基因对胃黏膜iNOS表达的影响。 方法　免疫组化技术对iNOS进行定位、定量测定 ,用双因素设计分析。结果　iNOS的表达主要见于浸润在固有层的炎性细胞的胞浆中。Hp密度对iNOS表达有影响 (P <0 .0 0 0 1) ,cagA+ 和cagA-组iNOS表达有差别 (P =0 .0 0 0 4 ) ,且二者对iNOS的表达有交互作用 (P =0 .0 0 4 6 )。在cagA+ 层内 ,各密度组间iNOS的表达有差别 (P <0 .0 0 0 1) ,随着密度的增高 ,iNOS表达水平增高 :3级较 2级组iNOS表达水平明显增高 [(16 1.35± 6 5 .13)vs(119.5 3± 2 8.12 ) ,P =0 .0 0 13],2级较 1级组iNOS表达水平高 ,且有统计学意义 [(119.5 3± 2 8.12 )vs (78.4 0± 2 7.18) ,P =0 .0 2 36 ];而在cagA-层内 ,随着密度的增高 ,各密度组间iNOS的表达水平有增高趋势 ,无统计学差异 [(6 0 .70± 13.0 7)vs(75 .75± 5 .32 )vs (76 .5 0± 19.17) ,P =0 .2 10 8]。在同一密度层内 ,cagA+ 与cagA-组iNOS表达有差异 :1级层内二者差别无显著性 [(78.4 0± 2 7.18)vs (6 0 .70± 13.0 7) ,P =0 .894 8],2级层内cagA+ 组较cagA-组iNOS表达增高 [(119.5 3± 2 8.12 )vs (75 .75± 5 .32 ) ,P =0 .0 0 0 1],3级层内cagA+

摘要：目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)检测肺结核患者痰液中的结核分枝杆菌(MTB)基因。方法以结核分枝杆菌高度保守的16S r DNA为靶基因设计3对特异性引物,收集2017年1~12月临床确诊的肺结核患者痰液89份,非肺结核患者痰液20份以及MTB标准菌株(H37RV),建立LAMP方法,并检测其特异性、灵敏性,以MTB培养结果为金标准,用SPSS13.0数据处理并进行统计学分析。结果成功建立LAMP检测痰液中MTB的方法,其特异性为100%,灵敏性为50 copies。在临床患者痰液检测中,特异性和灵敏性分别为85.00%、96.63%,与MTB培养结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 LAMP检测MTB特异性和灵敏度高,适用于基层医疗单位MTB的快速检测。