摘要：目的探讨阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)转基因小鼠在恐惧记忆活动中峰电位与场电位Gamma节律之间的内在联系。方法将6月龄APP/PS1/tau三转基因(3xTg)小鼠和野生型(WT)小鼠分为3xTg组和WT组,每组10只。无菌条件下在每组小鼠海马内埋置电极,两周后进行条件恐惧箱的行为学实验。通过小鼠头部埋置的无线遥测装置同步监测分析Gamma节律、Spike和Burst发放频率的变化情况,最后使用熵值计算Gamma节律与Spike的相关性。结果(1)在行为学实验中,3xTg小鼠因条件刺激引起的僵直比率为[(54.07±2.32)%],显著低于WT小鼠[(76.21±2.88)%](t=4.796,P<0.01)。(2)同步记录到WT小鼠在Pre-CS期Gamma节律的功率为[(11.574±1.147)dB],给予CS后上升为[(18.108±1.177)dB](t=3.386,P<0.01)。3xTg组在给予CS之后Gamma功率[(12.346±1.345)dB]明显低于WT组(t=3.423,P<0.01)。(3)WT小鼠在Pre-CS阶段Spike发放频率为[(5.667±1.475)次/s],给予条件刺激后显著升高[(11.008±1.335)次/s](t=3.542,P<0.01)。而3xTg小鼠的Spike发放频率在CS之后为[(5.249±1.033)次/s]明显低于WT组(t=4.788,P<0.01)。(4)WT组在Pre-CS和CS阶段Burst间隔时间分别为[(0.550±0.043)s]和[(1.075±0.034)s],可见WT组Burst发放频率在给予条件刺激之后显著增加(t=5.188,P<0.01)。而3xTg组经过条件刺激后发放间隔为[(0.619±0.033)s],显著低于WT组(t=3.352,P<0.01)。(5)给予条件刺激后,WT小鼠的Spike-Gamma熵值曲线始终高于3xTg小鼠,其中WT组和3xTg组的相关性最高值分别为(0.403±0.031)和(0.314±0.028),3xTg组的Spike-Gamma相关性与WT小鼠相比显著下降(t=3.372,P<0.01)。结论AD恐惧记忆的缺陷可能是由于Spike-LFP(Gamma)发放不协调导致的。

摘要：背景:特异性下调白细胞介素1β蛋白的表达可以有效缓解外周神经损伤后病理性疼痛。与si RNA相比,shR NA可以更加稳定、高效地抑制目的基因的表达,但是单纯的shR NA无法高效地进入靶细胞中发挥对目的基因的下调作用,而腺病毒载体具有宿主范围广、感染效率高以及能够在宿主细胞中稳定表达等特点。目的:构建大鼠白细胞介素1β基因的shR NA腺病毒载体并检测其对目的基因表达的影响。方法:根据NCBI查询获得的大鼠白细胞介素1β基因序列设计3条siR NA并合成相应的shR NA,分别为shR NA1、shR NA2、shR NA3。采用3’和5’单链退火得到的sh RNA片段与经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pH BAd/U6/GFP干扰载体连接,构建白细胞介素1βshR NA腺病毒载体穿梭质粒。测序后将穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293细胞,进行白细胞介素1β基因的shR NA腺病毒载体(rA d/shR NAs)的包装与扩增,分别为rA d/shR NA1、rA d/shR NA2、rA d/shR NA3。将r Ad/shR NAs感染大鼠H9C2细胞,使用荧光显微镜观察其感染效率,采用Western Blot检测r Ad/sh RNAs对目的基因表达的影响。结果与结论:测序结果显示白细胞介素1β基因的3条sh RNA腺病毒载体穿梭质粒中的序列分别与所设计的3条sh RNA序列相同;并成功构建了大鼠白细胞介素1β基因的shR NA腺病毒载体(r Ad/sh RNA1、rA d/shR NA2、rA d/sh RNA3)。rA d/shR NA1、rA d/sh RNA2、r Ad/shR NA3均可以下调白细胞介素1β的表达,其中r Ad/shR NA2的下调效果最明显。

摘要：目的克隆刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶(TgPDI)基因,原核表达、纯化重组TgPDI蛋白,并分析其免疫反应性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgPDI基因全长编码序列(登录号为AJ306291.2)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化大肠埃希菌(***)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切并测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗His抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白及其免疫反应性;重组蛋白His-TgPDI通过Ni2+琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,纯化蛋白经SDSPAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度。结果 RT-PCR扩增产物约为1 427 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得约57 kDa的可溶性重组蛋白。Western blotting结果表明,诱导表达的重组蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。亲和纯化后获得纯度大于95%的重组TgPDI蛋白质。结论克隆得到弓形虫PDI基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白,且该重组蛋白具有免疫反应性。

摘要：神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种由细胞增殖凋亡紊乱引起的先天缺陷性疾病。本室前期利用RNA-Seq技术,发现小鼠神经管畸形胚胎脑组织中DNA损伤诱导转录因子-4(DNA damage-inducible transcript 4,Ddit4)表达水平增加,但其在神经管畸形中的作用尚不清楚。本文拟探索Ddit4过表达对海马神经元HT-22细胞增殖和凋亡的影响及相关机制,从而为后续研究Ddit4在小鼠神经管畸形中的作用奠定基础。本研究首先根据小鼠Ddit4序列构建真核表达载体pEX-3-Ddit4,限制性酶切分析和测序结果表明pEX-3-Ddit4构建成功。qRT-PCR和Western印迹检测显示转染pEX-3-Ddit4后,HT-22细胞中DDIT4的表达水平明显增加(P<0.01)。CCK-8和Western印迹结果显示,Ddit4过表达导致HT-22细胞增殖下降(P<0.01)。流式细胞仪结果显示,转染pEX-3-Ddit4后,G0/G1期细胞比例增加、S期比例下降(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.05)。Western印迹检测发现,转染pEX-3-Ddit4能够显著上调切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase3)水平(P<0.05),表明Ddit4过表达促进HT-22细胞凋亡。细胞免疫荧光及Western印迹结果显示,过表达Ddit4显著降低细胞β-联蛋白(β-catenin)、T细胞因子4、细胞周期蛋白D1和C-myc的表达水平(P<0.05),核内β-联蛋白减少,提示Ddit4过表达抑制了Wnt/β-catenin信号通路。过表达Ddit4的同时加入Wnt/β-catenin信号通路激动剂LiCl处理细胞可逆转上述现象,表明Ddit4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路对HT-22细胞发挥抗增殖和促凋亡作用。

摘要：作者设计和使用的海马神经元细胞分离法是一种结合酶消化和机械分离的方法 ,既不损伤神经元的形态 ,又保留了神经元细胞膜的电学特征。形态上有差异的细胞易于分辨。用内面向外式膜片钳和全细胞膜片钳技术证实 ,约 95

摘要：补体系统作为重要的免疫组分之一,对机体的防御机能、免疫功能的调节以及免疫病理过程起着重要作用.正常机体内具有严密的调控机制,维持补体系统的自稳状态,抗补体活性便是其中的一种.血清抗补体活性的高低通常用血清对补体所介导的溶血实验的抑制程度来表示,由于通常所采用的CH100的方法测定补体活性时[1],不能精确反应补体活性的微细变化,而CH50的操作过程又过于复杂,国外学者已进行的一些研究,由于试验方法的不灵敏或不统一造成研究结果的不一致[2,3],从而掩盖了可能存在的临床意义.因而如何建立一种快速、简便、准确且有较好重复性的微量补体抑制实验,成为人们将补体抑制因子的研究引入临床所尚待解决的问题,为此我们设计了本研究.

摘要：目的利用过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）分解催化剂FeTMPyP探讨衰老大鼠血管舒张功能障碍的可能机制。方法选取雄性SD大鼠，随机分为成年组（3-4月，n=8）、衰老组（18-20月，n=8）及给予FeTMPyP的衰老组（n=6）；制备离体胸主动脉环，观察血管舒张功能；采用免疫组织化学法和Westernblot法测定血管组织中可代表ONOO^-生成的标记物3-硝基酪氨酸（3-NT）的表达。结果与成年组大鼠比较，衰老组大鼠胸主动脉环对10^-9-10^-5mol／L累积浓度的内皮依赖性舒张剂乙酰胆碱（ACh）的最大舒张程度显著下降[（29．74％±8．28％）vs（69．52％±5．51％），P〈0．001]；对10^-9-10^-5mol/L累积浓度的非内皮依赖性舒张剂硝普钠（SNP）的最大舒张程度也显著下降[（92．01％±3．19％）vs（99．26％±1．33％），P〈0．001]。与成年组大鼠比较，衰老组大鼠血管组织中3-NT蛋白表达增加（P〈0．05）。给予FeTMPyP后，衰老大鼠血管组织中3-NT蛋白表达下降（P〈0．01）；抑制ONOO^-的生成后，衰老大鼠胸主动脉环对累积浓度ACh的最大舒张程度显著升高[（65．96％±11．36％）vs（29．74％±8．28％），P〈0．001]，对累积浓度SNP的最大舒张程度也显著升高[（98．15％±2．79％）vs（92．01％±3．19％），P〈0．001]。结论FeTMPyP改善了衰老大鼠血管舒张功能，提示ONOO^-可能在衰老大鼠血管功能障碍中起重要作用。

摘要：目的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情为基础医学教育改革带来了机遇和挑战,线上教学成为必然选择,本研究拟探索可行的线上教学模式。方法作者在本校2018级临床医学兆泰班实施基于MOOC、SPOC和早临床设计的休克在线翻转课堂,利用中国大学MOOC免费开放的优质资源和自制微视频、教学课件等,在e-教学平台组建SPOC。课前学生随机分为5组,通过导学指导学生在线自主学习;通过腾讯会议进行翻转课堂,小组在线直播汇报和评估测试;课后通过案例分析和文献综合分析作业实现高阶学习目标。结果基于MOOC、SPOC和早期临床设计的在线翻转课堂取得了满意的学习效果。课程设计以学生为中心,注重早临床和能力素质培养,并形成课前、课中和课后的完整形成性评价。结论基于MOOC、SPOC和早期临床设计的在线翻转课堂为后疫情时代的教学改革提供了先行和借鉴。

摘要：为了研究去整合素echistatin RGD(Arg-Gly-Asp)模体周边氨基酸突变后对其生物学功能的影响,根据echistatin序列设计合成6个片段,利用重叠延伸PCR法合成cDNA,使echistatin RGD模体周边序列变为ARGDNM(D27→N),与载体pTXB1连接后转化***21(DE3),建立echistatin(ARGDNM)的表达体系.工程菌经IPTG诱导后融合蛋白表达量占菌体总蛋白约30%,几丁质亲和纯化后,DTT裂解释放目的蛋白分子量约5.4kD.体外血小板聚集和体内鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管新生实验结果表明,echistatin(ARGDNM)抑制血小板聚集的作用减弱,而其抑制血管新生的作用增强.RGD模体周围氨基酸的改变影响了去整合素的生物学功能,echistatin(ARGDNM)增强了与αⅤβ3结合的特异性,本工作为研究特异性更强的去整合素药物奠定了基础.

摘要：目的探讨衰老心肌中增加的Omi／HtrA2在心肌细胞自噬中的作用。方法用D-半乳糖干预胎鼠心肌细胞系H9c2建立衰老细胞模型，B-半乳糖苷酶染色观察细胞的衰老情况，cck8试剂盒检测细胞存活率，并以分析细胞乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）水平反映其活性；给予Omi／HtrA2特异性抑制剂ucf_101降低Omi／HtrA2活性，构建稳转Omi／HtrA2的H9c2细胞株过表达Omi／HtrA2；采用westernblot法测定心肌细胞中Omi／HtrA2、beclinl及***蛋白的表达。结果（1）与H9c2心肌细胞相比，D．半乳糖诱导的H9c2心肌细胞内B-半乳糖苷酶染色阳性率显著升高[（87．7±3．6％）VS（18．3±2_8％），P〈0．01]；cck8结果显示，两组之间无显著性差异（P〉0．05），但D-半乳糖诱导的H9c2心肌细胞中LDH活性明显升高（7．07±0．65w5．93±0．34，P〈0．01o（2）与H9c2细胞相比，D-半乳糖诱导的H9c24心肌细胞中Omi／HtrA2蛋白表达升高（P〈0．05），而beclinl表达下降（P〈0．01）；给予ucf-101后，衰老细胞中Omi／HtrA2蛋白表达明显下降（P〈0．05），而beclinl表达则进一步降低（P〈0．01）。（3）与H9c2细胞相比，过表达Omi／HtrA2的H9c2心肌细胞Omi／HtrA2蛋白表达增高，LC3-Ⅱ蛋白表达也增高（P〈0．05）；给予过表达Omi／HtrA2的H9c2心肌细胞ucf-101后，LC3-Ⅱ表达下降（P〈0．05o结论衰老心肌细胞中Omi／HtrA2的表达增加可促进心肌细胞自噬。