摘要：目的:观察杏仁核沉默信息调节因子1(SIRT1)蛋白对慢性束缚应激(CRS)大鼠抑郁样行为的影响。方法:60只SD雄性大鼠随机分为6组(n=10):正常对照组(Control)、慢性束缚应激组(CRS)、CRS+氟西汀(FLU)组(CRS+FLU)、CRS+生理盐水组(CRS+NaCl)、CRS+SIRT1过表达组(CRS+AAV-SIRT1)和CRS+空载体组(CRS+AAV-EGFP)。除了正常对照组,其余各组均接受慢性束缚应激造模21 d。造模结束后,氟西汀组和生理盐水组大鼠每天分别灌胃给予氟西汀(10 mg/kg)或生理盐水(10 mg/kg),持续3周;SIRT1过表达组和空载体组大鼠分别脑立体定位,注射腺相关病毒AAV-SIRT1或AAV-EGFP于杏仁核,待病毒表达3周;正常组和抑郁症组大鼠则不给予任何药物。应用糖水偏好实验(SPT)、旷场实验(OFT)和强迫游泳实验(FST)检测各组大鼠的抑郁样行为学变化;蛋白免疫印迹实验检测大鼠杏仁核中SIRT1蛋白的表达;免疫荧光技术检测大鼠杏仁核中SIRT1阳性细胞数量。结果:与正常对照组相比,CRS抑郁大鼠杏仁核中SIRT1蛋白水平和SIRT1阳性细胞数显著降低(P<0.01),糖水偏好程度明显降低(P<0.01),旷场实验中运动总距离和中心停留时间显著缩短(P<0.01),强迫游泳不动时间明显延长(P<0.01)。氟西汀治疗或SIRT1过表达均可以部分逆转CRS大鼠杏仁核SIRT1蛋白和SIRT1阳性细胞数的下调(P<0.05,P<0.01),并且可以显著改善上述抑郁样行为。结论:氟西汀治疗可以部分逆转CRS大鼠下调的SIRT1蛋白及SIRT1阳性细胞数,同时显著改善抑郁样行为,其抗抑郁疗效可能与CRS大鼠杏仁核中SIRT1蛋白的上调有关。

摘要：目的:探究电针(EA)通过激活μ-阿片受体(MOR)缓解大鼠痛情绪的机制。方法:预先在前扣带皮层喙侧部(rACC)分别注射生理盐水(NS)或MOR拮抗剂CTOP,并通过给大鼠左侧足底注射0.08 ml完全弗氏佐剂(CFA)建立条件位置逃避(CPA)模型,用电针(10 Hz,3 mA)或假电针(sham EA)刺激大鼠环跳穴(GB30)。行为测试完毕后,使用Western Blot检测rACC脑组织中的MOR蛋白表达以及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚基2A和2B(NR2A和NR2B)的磷酸化水平。通过免疫荧光双标技术分别观察大鼠MOR和NR2A或NR2B的共表达情况。结果:与对照组比,注射CFA的大鼠第3 d在痛环境停留时间明显比第1 d缩短(P<0.05)并且rACC脑区p-NR2A、p-NR2B水平升高(P<0.01);电针治疗减少了CFA引起的逃避时间(P<0.05),增加了MOR的表达(P<0.01);在rACC给予CTOP后电针的作用被反转;免疫荧光结果显示在rACC脑区同一神经元上MOR分别与NR2A或NR2B共表达。结论:电针可能通过激活rACC脑区中的MOR下调p-NR2A和p-NR2B水平达到缓解CFA诱导痛情绪的效果。

摘要：本文旨在根据小鼠脂联素受体-1(adiponectin receptor-1,AdipoR-1)的分子结构,制备抗AdipoR-1的多克隆抗体,为AdipoR-1的进一步研究创造条件。利用生物信息学分析预测小鼠AdipoR-1的理化特性、跨膜结构和抗原表位,结合AdipoR-1和AdipoR-2氨基酸序列相似性比对结果,设计出一段由16个氨基酸组成的多肽,用此肽段免疫大鼠得到多克隆抗体,利用ELISA、Westernblot等方法鉴定其特异性和滴度,并将该抗体用于正常及高胆固醇血症小鼠肌肉组织AdipoR-1的表达检测。结果表明,此抗体效价较高、特异性强。以上结果提示,生物信息学分析能较好地预测小鼠AdipoR-1的抗原表位,并成功制备高特异性的多克隆抗体。

摘要：目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株棒状体蛋白17(TgROP17)基因,并分析其抗原性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP17基因全长编码序列(GenBank登录号为AM075203.1)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pGEX-6P-1载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将重组质粒pGEX-6P-1-TgROP17转化至*** Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。分别以兔抗弓形虫血清和抗谷胱甘肽S转移酶(GST)标签抗体为一抗,采用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白及其抗原性。结果 RT-PCR扩增产物约为1850 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6P-1-TgROP17构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(M_r)约96 000的可溶性重组蛋白。Western blotting结果表明,诱导表达的蛋白质为带GST标签的重组蛋白,且能被兔抗弓形虫血清识别。结论获得刚地弓形虫重组ROP17蛋白,且具有抗原性。

摘要：目的构建刚地弓形虫RH株棒状体蛋白17(ROP17)真核表达载体,对表达产物进行激酶活性的检测和功能分析。方法根据刚地弓形虫ROP17蛋白编码基因(GenBank登录号为AM075203.1)设计引物,以弓形虫RH株速殖子总RNA为模板,RT-PCR扩增目的基因片段,克隆至真核表达载体p3×Flag-CMV-14,构建重组质粒p3×Flag-CMV-14/TgROP17。经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染至人胚肾细胞(HEK293T),RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析表达产物;Western blotting检测其激酶活性;流式细胞术分析ROP17对转染宿主细胞凋亡的影响。结果 RT-PCR结果显示,从RH株弓形虫速殖子中扩增出约1 850 bp的基因片段。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒p3×Flag-CMV-14/TgROP17构建成功且序列正确。RT-PCR和Western blotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/TgROP17的细胞中有TgROP17的表达,基因片段大小为1 850bp,蛋白质相对分子质量(Mr)约为70 000,而转染空质粒组未见表达。Western blotting结果显示,ROP17可以磷酸化c-Jun蛋白;流式细胞术结果显示,ROP17抑制喜树碱(CPT)诱导的细胞凋亡,6 h和12 h的抑制率分别为20.6%和24.1%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了真核表达载体p3×Flag-CMV-14/TgROP17,其表达产物具有激酶活性且能够抑制细胞凋亡。

摘要：目的通过生物信息学分析手段,对SARS-CoV-2侵袭宿主细胞的关键蛋白酶TMPRSS2进行预测和分析,对其结构与功能进行系统性的整理,为该蛋白的研究及其抑制剂的研发提供可靠的参考。方法通过ProtParam、Protscale、SignalP 4.0 Server、SecretomeP 2.0 server、TMHMM Server v.2.0、SOPMA、SWISS-MODEL、MEGA-X等软件对TMPRSS2基因及蛋白进行结构、功能、进化、生物过程等方面的预测,综合各软件得出的结果做出分析及论证。结果TMPRSS2蛋白是一种由492个氨基酸组成的亲水性蛋白,它具有一个跨膜螺旋结构,是一种非经典分泌蛋白。TMPRSS2蛋白在前列腺中的表达尤为丰富,其共有3个可能的N-糖基化位点,3个可能的O-糖基化位点以及8个可能的蛋白磷酸化位点。TMPRSS2蛋白共拥有3个超家族保守结构域,其100位以后的氨基酸序列相对保守。结论本文借助生物信息学相关软件和数据库,对TMPRSS2蛋白的结构和功能展开了较为全面的预测和分析。进一步验证了其作为丝氨酸蛋白酶的特质,同时也为其参与SARS-CoV-2侵袭宿主提供可能的机制解释。有助于进一步开展TMPRSS2相关的实验及研究。

摘要：目的克隆刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1(TgRACK1)基因,原核表达、纯化TgRACK1,并分析其抗原性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgRACK1基因全长编码序列(GenBank登录号:AY547291)的开放阅读框设计引物并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pGEX-6p-1载体,重组质粒转化大肠埃希菌DH5α,阳性菌落经菌液PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定。将重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1转化至大肠埃希菌BL21(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗GST标签抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,免疫印迹(Western blotting)分析鉴定重组蛋白及其抗原性。重组融合蛋白经GST琼脂糖凝胶亲和纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度。结果 RT-PCR扩增产物约为970 bp,重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1构建成功。经IPTG诱导获得相对分子质量约63 kDa的可溶性重组蛋白。诱导表达的蛋白质为带GST标签的重组融合蛋白,且能被兔抗弓形虫血清识别。亲和纯化后获得纯度大于95%的重组TgRACK1蛋白质。结论克隆得到弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白质,且该重组蛋白具有抗原性。

摘要：背景:特异性下调白细胞介素1β蛋白的表达可以有效缓解外周神经损伤后病理性疼痛。与si RNA相比,shR NA可以更加稳定、高效地抑制目的基因的表达,但是单纯的shR NA无法高效地进入靶细胞中发挥对目的基因的下调作用,而腺病毒载体具有宿主范围广、感染效率高以及能够在宿主细胞中稳定表达等特点。目的:构建大鼠白细胞介素1β基因的shR NA腺病毒载体并检测其对目的基因表达的影响。方法:根据NCBI查询获得的大鼠白细胞介素1β基因序列设计3条siR NA并合成相应的shR NA,分别为shR NA1、shR NA2、shR NA3。采用3’和5’单链退火得到的sh RNA片段与经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pH BAd/U6/GFP干扰载体连接,构建白细胞介素1βshR NA腺病毒载体穿梭质粒。测序后将穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293细胞,进行白细胞介素1β基因的shR NA腺病毒载体(rA d/shR NAs)的包装与扩增,分别为rA d/shR NA1、rA d/shR NA2、rA d/shR NA3。将r Ad/shR NAs感染大鼠H9C2细胞,使用荧光显微镜观察其感染效率,采用Western Blot检测r Ad/sh RNAs对目的基因表达的影响。结果与结论:测序结果显示白细胞介素1β基因的3条sh RNA腺病毒载体穿梭质粒中的序列分别与所设计的3条sh RNA序列相同;并成功构建了大鼠白细胞介素1β基因的shR NA腺病毒载体(r Ad/sh RNA1、rA d/shR NA2、rA d/sh RNA3)。rA d/shR NA1、rA d/sh RNA2、r Ad/shR NA3均可以下调白细胞介素1β的表达,其中r Ad/shR NA2的下调效果最明显。

摘要：目的探讨阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)转基因小鼠在恐惧记忆活动中峰电位与场电位Gamma节律之间的内在联系。方法将6月龄APP/PS1/tau三转基因(3xTg)小鼠和野生型(WT)小鼠分为3xTg组和WT组,每组10只。无菌条件下在每组小鼠海马内埋置电极,两周后进行条件恐惧箱的行为学实验。通过小鼠头部埋置的无线遥测装置同步监测分析Gamma节律、Spike和Burst发放频率的变化情况,最后使用熵值计算Gamma节律与Spike的相关性。结果(1)在行为学实验中,3xTg小鼠因条件刺激引起的僵直比率为[(54.07±2.32)%],显著低于WT小鼠[(76.21±2.88)%](t=4.796,P<0.01)。(2)同步记录到WT小鼠在Pre-CS期Gamma节律的功率为[(11.574±1.147)dB],给予CS后上升为[(18.108±1.177)dB](t=3.386,P<0.01)。3xTg组在给予CS之后Gamma功率[(12.346±1.345)dB]明显低于WT组(t=3.423,P<0.01)。(3)WT小鼠在Pre-CS阶段Spike发放频率为[(5.667±1.475)次/s],给予条件刺激后显著升高[(11.008±1.335)次/s](t=3.542,P<0.01)。而3xTg小鼠的Spike发放频率在CS之后为[(5.249±1.033)次/s]明显低于WT组(t=4.788,P<0.01)。(4)WT组在Pre-CS和CS阶段Burst间隔时间分别为[(0.550±0.043)s]和[(1.075±0.034)s],可见WT组Burst发放频率在给予条件刺激之后显著增加(t=5.188,P<0.01)。而3xTg组经过条件刺激后发放间隔为[(0.619±0.033)s],显著低于WT组(t=3.352,P<0.01)。(5)给予条件刺激后,WT小鼠的Spike-Gamma熵值曲线始终高于3xTg小鼠,其中WT组和3xTg组的相关性最高值分别为(0.403±0.031)和(0.314±0.028),3xTg组的Spike-Gamma相关性与WT小鼠相比显著下降(t=3.372,P<0.01)。结论AD恐惧记忆的缺陷可能是由于Spike-LFP(Gamma)发放不协调导致的。

摘要：目的观察钠-钙交换体单克隆抗体NCX-2D2对异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱发大鼠心律失常的影响,并探讨其电生理机制。方法利用ISO建立大鼠离体和在体心律失常模型,观察NCX-2D2抗体对心律失常的影响;通过全细胞膜片钳技术,观察NCX-2D2抗体对大鼠心室肌细胞I_(Na/Ca)、I_(Ca-L)和DADs的作用。结果 10 mg·L^(-1) 2D2抗体可明显抑制ISO诱发大鼠离体心脏心律失常的发生(P<0.01);80μg·kg^(-1) 2D2抗体可明显抑制ISO诱发麻醉大鼠心律失常的发生(P<0.01);5 mg·L^(-1) 2D2抗体可部分抑制ISO对大鼠心室肌细胞I_(Na/Ca)的增大作用(P<0.01),以及对I_(Ca-L)的增大效应(P<0.01),并可有效抑制ISO诱发大鼠心室肌细胞DADs的发生(P<0.05)。结论钠-钙交换体单克隆抗体NCX-2D2可明显抑制异丙肾上腺素诱发的大鼠室性心律失常,其抗心律失常机制与抑制心肌细胞钠-钙交换体和L-型钙通道,从而减轻钙超载和抑制延迟后除极有关。