摘要：通过多种生物信息学工具对CDK4/6蛋白质特性进行系统性分析,对这2种蛋白质产生更深入的了解,并以分析结果为基础,提出针对乳腺癌的CDK4/6抑制剂的设计策略。利用三维建模、位点预测、蛋白相互作用网络构建等软件对CDK4/6的蛋白质结构、翻译后修饰位点、蛋白质相互作用关系及其参与的生物学过程、通路等进行预测分析。CDK4/6均具有较为特殊的三级结构,可为其抑制剂的设计提供有利条件;2种蛋白都存在一定数量的蛋白磷酸化位点及O-糖基化位点,但不存在N-糖基化位点;与CDK4/6产生相互作用的蛋白质数量众多,但大部分为CDK蛋白家族成员及CCN蛋白家族成员;GO及KEGG分析结果显示,2种蛋白共同参与p53信号通路及PI3K-Akt信号通路,并在细胞对外界刺激的反应中起到作用。预测及分析结果表明,可通过空间特异性结合、修饰位点抢占及变构、多通路多形式共同抑制等方式对CDK4/6抑制剂进行设计和改造。为该类研究的进一步发展铺垫了理论基础,为探索多元化癌细胞抑制方案提供了新的思路和角度。

摘要：目的构建雌激素受体α配体结合域(ERα-LBD)表达载体,优化表达条件得到可溶性ERα-LBD蛋白。方法在Addgene网站检索关键词ESR(雌激素受体,estrogen receptor),选择符合条件的质粒载体pcDNA-HA-ER WT(Addgene plasmid # 49498;http://***/addgene:49498;RRID:Addgene49498),设计引物并扩增得到目的片段ERα-LBD,分别构建蛋白表达载体pET-28a-LBD和pGEX-4T1-LBD,改变诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度以及诱导时间对表达条件优化。待细菌裂解并提取蛋白后进行凝胶电泳,可在细菌上清的泳道中观察到明显的紫色蛋白表达条带,即为可溶性ERα-LBD蛋白。结果 pET-28a-LBD重组质粒未能表达重组蛋白ERα-LBD,重组质粒pGEX-4T1-LBD在Rosetta和BL21(DE3)感受态中以1 mmol/L IPTG诱导仅能得到包涵体;以0.2 mmol/L IPTG 16 ℃过夜诱导培养,则可得到可溶性ERα-LBD蛋白。结论成功构建ERα-LBD表达载体并优化诱导表达条件,获得可溶性ERα-LBD蛋白。

摘要：目的克隆Nucleophosmin(NPM)的编码序列,构建含Nucleophosmin基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌多药耐药中的作用奠定基础。方法根据已发表的Nucleophosmin基因的核苷酸序列设计合成一对引物,以人乳腺癌组织抽提的RNA为模板进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,用限制性内切酶酶切重组质粒pEGFP/NPM和DNA序列测定进行鉴定。用脂质体法将pEGFP/NPM导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组织化学法和RT-PCR鉴定其表达。结果 RT-PCR扩增出长894bp的特异性片段,经克隆至pEGFP-N1后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pEGFP/NPM在HepG2细胞中有稳定表达。结论成功克隆了NPM的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pEGFP/NPM/1,有助于对NPM基因在肝癌多药耐药中的机制做进一步研究。