摘要：目的分离鉴定犬钩虫C型凝集素AcaCTL-1基因,并在大肠埃希菌中表达。方法根据EST序列设计引物,用RT-PCR及3′(RACE技术扩增获得AcaCTL-1全长cDNA序列,并对其进行初步生物信息学分析;将AcaCTL-1成熟肽编码序列克隆、连接到表达载体pET32a,构建重组质粒pET32a/AcaCTL-1;在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE分析表达情况,Ni亲和层析纯化可溶性蛋白。结果成功克隆了AcaCTL-1全长cDNA序列,其最大开放阅读框由525 bp组成,预测编码174个氨基酸残基组成的蛋白,含17个氨基酸组成的信号肽,为C型凝集素家族蛋白成员;构建pET32a/AcaCTL-1重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达。表达产物多以包涵体形式存在,小部分为可溶性蛋白。结论成功克隆并表达了犬钩虫C型凝集素AcaCTL-1基因,为进一步了解AcaCTL-1的功能奠定了基础。

摘要：目的 构建家蝇幼虫抗菌肽的真核表达载体,并检测它在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达情况.方法 以pUCm-T/Defensin为模板,设计带His标签特异引物,扩增C-末端融合6×His标签的Defensin基因的cDNA全长编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以阳离子脂质体Lipofect AmineTM 2000转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定转染的阳性克隆细胞,以RT-PCR分析其mRNA的转录情况,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以Western免疫印迹鉴定蛋白质表达情况.结果 构建了pcDNA3.1 （＋）-Defensin-His表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.RT- PCR从阳性克隆CHO细胞系中扩增出320 bp大小的目的片段,从转录水平证实pcDNA3.1（＋）-Defensin-His重组细胞株表达了Defensin基因.Western免疫印迹检测可见相对分子质量为10000的阳性条带,表明Defensin-His在该细胞系中成功表达.结论 成功构建了质粒pcDNA3.1（＋）-Defensin-His,并获得了稳定表达的CHO-Defensin细胞株,有利于进一步研究家蝇幼虫抗菌肽Defensin基因的生物学功能.