摘要：目的利用慢病毒介导构建磷酸二酯酶7A(PDE7A)基因沉默人单核巨噬细胞(THP-1)株,并分析沉默细胞株的三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达变化。方法以PDE7A基因为靶点,设计合成3段sh RNA片段,与慢病毒载体Pmi Rzip连接,构建重组质粒。测序鉴定后进行病毒包装,感染THP-1细胞,实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)进行分析,确定最佳干扰片段。嘌呤霉素筛选得到PDE7A基因沉默稳转细胞株。q PCR和Western blot检测鉴定所构建的细胞株,将其诱导成为泡沫细胞后鉴定ABCA1基因的表达。结果转染sh RNA1、sh RNA2、sh RNA3细胞的PDE7A相对表达量分别为(0.480±0.028)、(0.561±0.016)和(0.377±0.013),故选择sh RNA3作为干扰PDE7A基因的最佳片段。采用1.4 g/L嘌呤霉素成功筛选出PDE7A沉默细胞株,q PCR和Western blot检测PDE7A基因的干扰效率,其抑制效率>70%。将其诱导成巨噬泡沫细胞后,Western blot检测显示,ABCA1的表达量增加40%。结论成功构建PDE7A sh RNA慢病毒干扰载体,并筛选出PDE7A基因沉默的THP-1细胞株,且ABCA1的表达量增加。

摘要：目的构建存活素(SURVIVIN)基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒,为肺癌RNA干扰(RNAi)途径的基因治疗打下基础。方法设计并合成SURVIVIN短发夹结构模板序列,与穿梭载体重组质粒后转染人肺癌细胞A549,通过RT-PCR法筛选出抑制效果最强的质粒;MTT和Western blot法检测该质粒对细胞增殖和SURVIVIN表达的影响。结果构建和筛选出抑制作用最强的质粒;该质粒能明显抑制A549细胞的增殖和SURVIVIN的表达。结论在RNAi的介导下,SURVIVIN的表达被下调,为肺癌的基因治疗提供实验依据。

摘要：2006年3月14日,美国国家科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)以封面论文形式刊载了纽约大学医学院研究者的最新发现:快速脱腺苷酸化是miRNA抑制基因表达的新机制.这一结果在理论上进一步丰富了对基因调控的认识,同时在药物设计及疾病治疗等实际应用中也有很大的潜力.

摘要：目的:构建存活素(survivin)基因短发夹RNA(shR-NA)的表达质粒,为乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.方法:设计并合成有小发夹结构的8条survivinshRNA对应模板序列,退火并与pShuttle 1.0-CMV载体重组质粒;将重组质粒转染人乳腺癌细胞MCF-7;MTT实验筛选出最有效质粒及其有效浓度,流式细胞术检测细胞周期的变化,经Hoechst染色观察凋亡情况,RT-PCR和Western Blot检测survivin基因的表达情况.结果:成功构建重组质粒并筛选出最有效质粒及其有效浓度;细胞受阻于G2/M期,并通过荧光染色发现有凋亡细胞;survivin基因表达受到抑制.结论:构建的重组质粒能抑制survivin基因的表达,这为研究乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.

摘要：为认识葫芦科植物中葫芦素生物合成途径所需鲨烯合酶基因结构特征,克隆白皮黄瓜鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因c DNA并进行生物信息学分析。根据葫芦科植物绞股蓝、罗汉果、红花栝楼等的鲨烯合酶基因cDNA序列,设计白皮黄瓜鲨烯合酶引物,分别采用3'RACE和5'RACE技术扩增鲨烯合酶基因3'端和5'端。获得白皮黄瓜鲨烯合酶基因的两个cDNA克隆,命名为CsSS1和CsSS2,其cDNA序列全长分别为1 627 bp和1 534 bp,都编码417个氨基酸残基,分子质量为47.6 k D。成功克隆得到白皮黄瓜鲨烯合酶基因全长cDNA序列并对其进行序列分析,后续可用于葫芦素生物合成途径所需鲨烯合酶基因正选择位点功能分析。

摘要：目的采用常规转染试剂难以将人β-COP-shRNA转染至THP-1细胞。构建人β-COP特异性的shRNA慢病毒载体,并测定其对靶基因β-COP的抑制效应。方法设计合成针对人β-COP基因靶点特异的4对shRNA寡聚单链DNA,插入p GMLV-SC1载体中,构建慢病毒重组载体。将重组载体和包装质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。用慢病毒感染THP-1细胞,定量PCR和Western blot检测干扰载体对β-COP基因的干扰效果。结果测序证实,β-COP基因的shRNA寡聚核苷酸序列已插入慢病毒载体,转染HEK 293T细胞,经包装得到4种慢病毒,病毒滴度为1×109TU/m L。定量PCR分析显示,4种β-COP-shRNA慢病毒感染的THP-1细胞中β-COP基因mRNA表达量分别为0.831±0.065、0.675±0.079、0.260±0.050、0.497±0.067,较对照(1.000±0.000)明显升高(P<0.01);其抑制率分别为16.9%、32.5%、74.0%和50.3%。Western blot结果表明,4种干扰载体均可抑制β-COP蛋白表达,其中β-COP-shRNA 3的沉默效率为76.4%。结论成功构建了人β-COP-shRNA干扰载体,证实了干扰载体对靶基因有较好的沉默效果。

摘要：目的观察腺苷酸环化酶AC1和AC4对泡沫细胞胆固醇流出的影响。方法以人AC1和AC4基因为靶点,设计合成sh RNA寡核苷酸片段,插入慢病毒载体p GMLV-SC1,构建重组慢病毒载体。用构建的AC-sh RNA慢病毒感染THP-1细胞,q PCR检测干扰载体对AC1和AC4基因的干扰效果。慢病毒感染泡沫细胞后,采用液体闪烁计数法测定apo A-1介导的泡沫细胞胆固醇流出率。结果测序结果表明,AC1和AC4基因的sh RNA寡聚核苷酸序列已成功插入慢病毒载体。荧光观察显示,两种慢病毒的感染效率达80%。q PCR分析表明,AC1-sh RNA和AC4-sh RNA干扰载体对靶基因有明显的抑制效果(P<0.01),其抑制效率分别为83.9%和80.1%。AC1和AC4-sh RNA慢病毒感染泡沫细胞后,胆固醇流出明显降低(P<0.01)。结论本实验初步证实AC1和AC4可降低泡沫细胞胆固醇流出,提示其可能在胆固醇代谢中起作用。

摘要：针对Western Blot以及DNA电泳等实验研究结果定量分析主要应用凝胶成像系统完成,定量分析软件操作流程繁琐的特点,设计出一个适用于Western Blot及DNA电泳等结果定量分析系统。介绍系统中图像处理的问题:图像二值化、分割与感兴趣区域提取、定量分析中的面积计算,着重从计算机图像处理的角度说明定量分析的解决方案。实验证明,系统能够减少实验员人工干预操作,定量分析结果能够满足Western Blot及DNA电泳等实验研究定量分析的应用需要。

摘要：目的:构建存活素(Survivin)基因短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)重组质粒并测序鉴定,为下一步探索乳腺癌基因治疗的RNA干扰途径建立基础。方法:设计并合成有小发夹结构的8条DNA片段,退火成互补双链后克隆至pSilencer adeno 1.0-CMV载体中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后测序分析。结果:酶切鉴定和测序结果证实构建成功。结论:survivinshRNA重组质粒的成功构建为下一步用腺病毒包装,并感染荷瘤裸鼠行靶向RNA干扰抗乳腺癌的研究打下基础。