摘要：【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)Galectin-4基因(记作OnGal-4)的原核表达,为大量获取尼罗罗非鱼Galectin-4蛋白(OnGal-4)和后续功能研究奠定基础。【方法】根据NCBI上公布的尼罗罗非鱼Galectin-4基因序列(Genbank:XM-019345120)设计引物,构建原核表达载体,诱导Galectin-4重组蛋白(r OnGal-4)在BL21原核表达系统中表达,并优化其诱导条件。【结果与结论】成功扩增出OnGal-4基因,并构建原核表达载体pGEX-4T-On Gal-4。rOnGal-4最佳诱导条件是温度28℃,IPTG浓度0.4 mmol/L,诱导时间4 h。在此条件下,rOnGal-4在可溶性蛋白中大量表达。Western-blot结果显示,rOnGal-4可与抗GST标签的单克隆抗体发生特异性反应。

摘要：【目的】补体3(Complement3,C3)在罗非鱼的抗病感染中有重要作用,研究C3基因判断原核表达及表达条件。【方法】根据NCBI中已公布罗非鱼补体C3的基因序列,选取C3基因片段,设计一对带有酶切位点的特异性引物,经连接、转化等后,使用限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI对克隆成功的C3基因片段以及原核表达载体pGEX-4T进行双酶切,构建重组质粒pGEX-4T-C3,导入大肠杆菌进行原核表达,并优化表达条件,并对纯化目的蛋白进行Western Blot鉴定。【结果】C3基因片段的重组质粒pGEX-4T-C3构建成功。罗非鱼C3基因片段编码区长度为1 341 bp。获得的目的蛋白分子质量为75 ku,与预期结果相符。最佳诱导时间、浓度以及温度分别为4 h、0.2 mmol/L以及37℃;目的蛋白主要以包涵体的形似存在。重组蛋白可以与GST-Tag单克隆抗体特异性结合,说明成功获得罗非鱼C3片段的重组蛋白。

摘要：鱼类诺卡氏菌病是全球性的鱼病,杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)是引起鱼类诺卡氏菌病的主要病原之一。根据杀鲑诺卡氏菌16S-23S转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立特异性PCR检测杀鲑诺卡氏菌的方法。结果表明,筛选的PCR引物可特异性地扩增出杀鲑诺卡氏菌的ITS片段,检测灵敏度(DNA浓度)为28.3 pg·μL-1。检测人工感染杀鲑诺卡氏菌的鱼组织,结果显示,该方法可从未分离到病原菌的病鱼组织中检出阳性片段,较传统细菌分离鉴定方法更为高效灵敏。

摘要：参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.

摘要：【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。【结果】标准曲线在2.5×10^8~2.5×10^0拷贝数之间有良好的线性关系(相关系数R2=0.999),检测限为2.5×100个拷贝。试验内及试验间变异系数分别为0.11%~0.43%与0.54%~1.13%,重复性强;对水生动物其他病毒和细菌均无扩增反应,有很好的特异性。【结论】新建立的罗湖病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可用于TiLV的早期的快速诊断、流行病学调查和防控。

摘要：【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)CD247基因(Gen Bank登录号:MF975639;On-CD247),分析On-CD247的生物信息学特征及其在正常和经灭活无乳链球菌注射刺激的尼罗罗非鱼组织中的表达。【方法】设计CD247基因引物并对CD247基因片段进行扩增,运用荧光定量PCR技术分析尼罗罗非鱼CD247组织分布。【结果与结论】CD247基因编码区为453 bp,编码150个氨基酸,理论分子质量为16.9 ku,等电点为6.33,在跨膜区域有保守的ASP27、Asp35残基,胞内具有三段保守的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。On-CD247序列与红笛鲷(Lutjanus sanguineus)相似性最高,为74.0%,与其他鱼类的相似性介于35.8%～73.0%之间。On-CD247在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,其中在胸腺中表达量最高,其次是皮肤、肌肉、鳃,在头肾中表达量最低。经灭活无乳链球菌刺激后,On-CD247的表达量在胸腺、头肾和肠道中均显著上调,而在脾脏中却显著下调,且有明显的时序性。胸腺、头肾和肠道均在3 h表达量最高,脾脏在12 h表达量最低,头肾中的表达量也在12 h回落,表明On-CD247表达可被无乳链球菌所诱导。

摘要：为建立一种鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)多重PCR的分型方法,对已公布的20个鰤鱼诺卡氏菌全基因组数据进行对比分析,筛选鰤鱼诺卡氏菌种内差异基因片段并设计PCR引物,经单重PCR验证确认后进行引物组合、引物配比优化,构建鰤鱼诺卡氏菌的多重PCR菌株分型方法,并对该菌株分型方法进行灵敏度分析和病例应用。结果表明:在试验中构建的多重PCR菌株分型方法可用于鰤鱼诺卡氏菌培养物和感染鱼样分型,并确认鰤鱼诺卡氏菌ArsC、AraC、ISOPREN、ALAT、IclR基因片段具有种内差异;其中多重PCR引物组合Ⅰ(ISOPREN-F/R、ALAT-F/R、IclR-F/R)引物最优配比为ISOPREN-F/R∶ALAT-F/R∶IclR-F/R=2∶1∶2,灵敏度达125 pg/μL,组合Ⅱ(AraC-F/R、ALAT-F/R、IclR-F/R)引物最佳配比为AraC-F/R∶ALAT-F/R∶IclR-F/R=1∶1∶1,灵敏度达500 pg/μL,组合Ⅲ(ArsC-F/R、ALAT-F/R、IclR-F/R)引物最佳配比为ArsC-F/R∶ALAT-F/R∶IclR-F/R=1∶2∶2,灵敏度达500 pg/μL。研究表明,本研究中建立的鰤鱼诺卡氏菌的多重PCR菌株分型方法,可在1~2 h内完成鰤鱼诺卡氏菌的菌株分型鉴定,为水产实践中鰤鱼诺卡氏菌感染病例的菌株分型提供了快速、准确、实用的鉴定方法,可助力鱼类诺卡氏菌病的防控。

摘要：根据GenBank上登录的红笛鲷SR-BⅠ基因设计引物,采用RT-PCR方法扩增该基因胞外段序列,然后将该基因胞外段序列定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,将重组质粒转入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,并对重组表达菌株的表达条件进行优化。结果显示,成功构建了原核表达载体pET28a-SR-BI,并能在大肠杆菌BL21中表达,表达的融合蛋白分子量为50.0ku。融合蛋白的最佳诱导表达温度、IPTG浓度和时间分别为16℃、0.05mmol/L和8h。研究结果为进一步研究SR-BI的功能奠定了基础。

摘要：Galectin-related protein B是一种缺乏半乳糖苷结合活性的半乳糖凝集素相关蛋白B。基于NCBI公布的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)Galectin-related protein B基因序列设计带酶切位点引物,构建原核表达载体pET-28a-GRPB,将重组质粒导入大肠杆菌,诱导重组质粒的蛋白表达,并对蛋白表达条件进行优化。结果表明:在28℃条件下,IPTG浓度为0.20mmol/L,诱导6h时,诱导重组蛋白的效果最佳;经Western-blot免疫印迹显示,纯化后的重组蛋白能与带HIS标签的单抗特异结合,条带单一,进一步证明该重组蛋白为Galec⁃tin-related protein B蛋白。

摘要：Galectin-8属于S型凝集素,是一种内源性凝集素,具有高亲力,含β-半乳糖苷,可识别重要的病原分子[1]。该蛋白质有2个功能结构域,均提供该家族中其他蛋白质类似的保守序列[2]。该研究基于尼罗罗非鱼Galectin-8 NCBI上发表的基因序列,利用primer5.0设计1对引物,构建尼罗罗非鱼Galectin-8基因的原核表达载体,将重组后的质粒pGEX-4T-1-Galectin-8导入大肠杆菌中,通过PCR、连接、转化等,进行原核表达。对影响因素进行条件优化,使用优化后的浓度、时间、温度条件表达Galectin-8重组蛋白能得到最优表达量。Western blot检测纯化后的重组蛋白,结果显示,重组蛋白可以很好地结合GST-Tag标签的单克隆抗体,实验进一步证明罗非鱼Galectin-8的重组蛋白被成功表达,为罗非鱼Galectin-8后续相关功能的研究奠定了基础。