摘要：目的研究靶向血管内皮生长因子(VEGF)基因的外源性miRNA对恶性黑色素瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法根据VEGF基因序列设计合成4对miRNA干扰片段,构建质粒真核表达载体,分别为X-26-1-3、X-26-2n-1、X-26-3-2和X-26-4-4,测序分析鉴定插入序列的完整性;脂质体法将该4个重组表达载体转染黑色素瘤细胞株SKmel-28,RT-PCR检测转染细胞中VEGF基因的mRNA表达变化,Western blotting检测miRNA对VEGF蛋白表达水平的调控效应,明确抑制效果最为显著的miRNA干扰序列。MTS法和流式细胞仪分别检测人工合成的靶向VEGF的miRNA对SKmel-28生长的抑制作用,以及对肿瘤细胞凋亡的影响。结果测序分析证实4个重组体插入片段的碱基序列均完全正确,成功转染SKmel-28细胞后,均能显著抑制肿瘤细胞VEGF mRNA和蛋白的表达,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。抑制效应最强的重组载体是X-26-2n-1,MTS法和流式细胞仪检测显示,SKmel-28细胞转染X-26-2n-1后,细胞增殖受到明显抑制,增殖抑制效应具有时间依赖性,与阴性对照组比较差异具有显著性(P<0.05),与空白组比较细胞增殖抑制更加明显(P<0.01);肿瘤细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率也显著高于对照组(P<0.01)。结论外源性靶向VEGF的miRNA能够显著降低黑色素瘤细胞SKmel-28 VEGF基因和蛋白的表达水平,抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡。

摘要：【目的】研究外源性靶向microRNA对恶性黑色素瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的抑制作用,以及对癌细胞增殖和侵袭迁移能力的影响。【方法】根据VEGF基因序列人工设计合成4对microRNA干扰片段,构建质粒真核表达载体,分别为:X-26-1-3、X-26-2n-1、X-26-3-2和X-26-4-4,测序分析鉴定插入序列的完整性;脂质体法将该四个重组表达载体转染黑色素瘤细胞株SKmel-28,RT-PCR检测转染细胞中VEGF基因的mRNA表达变化,Western Blot检测microRNA对VEGF蛋白表达水平的调控效应,明确抑制效果最为显著的microRNA干扰序列。MTS和EDU法分别检测靶向VEGF的microRNA对SKmel-28生长的抑制作用,流式细胞仪观察转染对肿瘤细胞凋亡的影响,Transwell检测细胞侵袭和迁移能力变化。【结果】测序分析证实4个重组体插入片段的碱基序列均完全正确,成功转染SKmel-28细胞后,均能显著抑制肿瘤细胞VEGF mRNA和蛋白的表达,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。抑制效应最强的重组载体是X-26-2n-1;MTS和EDU检测显示,SKmel-28细胞转染X-26-2n-1后,细胞增殖受到明显抑制,与对照组相比有统计学差异(P<0.05),增殖抑制效应具有时间依赖性,细胞侵袭和迁移能力也显著减弱(P<0.01);流式细胞仪检测显示肿瘤细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率也显著高于对照组(P<0.01)。【结论】外源性靶向VEGF的microRNA能够显著降低黑色素瘤细胞SKmel-28 VEGF基因和蛋白的表达水平,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的体外增殖和侵袭迁移能力。

摘要：目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以HER-2为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/ GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.再转染人大肠癌HT29细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,并可以进行稳定筛选.

摘要：目的通过实验验证ANLN为microRNA-217（miR-217）的靶基因。方法使用生物学软件预测miR-217调控的靶基因可能为ANLN。设计并合成mR-217结合的ANLN及突变型ANLN（mutANLN）序列，将其PCR扩增的片段插入表达质粒psiCHECK-2，构建重组质粒***及psiCHECK-2-mutANLN。采用脂质体法将2个重组质粒单独或分别与miR-217、miR．217inhibitor及与人同源性远的miRNA序列（NC）、NCinhibitor共转染胰腺癌PANCl细胞，采用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性，采用蛋白质印迹法检测ANLN蛋白的表达。结果转染psiCHECK-2-ANLN、psiCHECK-2-ANLN＋miR-217、psiCHECK-2-ANLN＋miR-217inhibitor、psiCHECK-2-ANLN＋NC、psiCHECK-2-ANLN＋NCinhibitor各组问的荧光素酶活性分别为2．221±0．188、0．7694-0．061、3．764±0．371、2．265±0．201、2．242±0．018，差异有统计学意义（F=77．405，P〈0．01），但psiCHECK-2-ANLN组、psiCHECK-2-ANLN＋NC组及psiCHECK-2-ANLN＋NCinhibitor组两两比较差异无统计学意义，而psiCHECK-2-ANLN＋miR-217组的荧光素酶活性较这3组明显下降，psiCHECK-2-ANLN＋miR-217inhibitor组活性较其他4组明显升高（P值均〈0．01）。转染psiCHECK-2-mutANLN各组间荧光素酶活性差异无统计学意义（P=0．053）。***＋miR-217共转染组PANC1细胞的ANLN蛋白表达水平较单纯转染psiCHECK-2-ANLN组细胞的ANLN蛋白表达明显下调。结论在胰腺癌中，ANLN可能是miR-217的直接靶基因。