摘要：目的建立RT-LAMP方法,实现对狂犬病病毒核酸的快速、灵敏、简便的检测。方法针对狂犬病病毒的核衣壳蛋白基因(N基因)和大转录酶蛋白基因(L基因)中的高度保守区段分别设计了一套引物,建立了检测狂犬病病毒的快速一步式反转录-环介导恒温扩增(RT-LAMP)方法。样品提取总RNA后,加入BstDNA聚合酶、各种反应成分,于63℃恒温水浴箱中放置60min,80℃5min终止反应,加入荧光染料SYBR GREEN I,根据颜色变化肉眼判定结果。结果两套引物对狂犬病病毒RNA进行RT-LAMP检测,均有良好的特异性,灵敏度均比RT-巢式PCR高10倍以上。结论该方法简单、快速,不需电泳,利用染色剂肉眼判定结果,不需要大型仪器,能在70min内完成对狂犬病病毒RNA的检测,适用于可疑动物的快速检测,尤其适合基层使用。

摘要：根据猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株及变异毒株(HB-1、SY0608、HN-HW、HuN4等)的核苷酸序列,利用Primer软件设计合成针对PRRSV Nsp9基因保守区域的特异性引物。用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒JL/07/SW株Nsp9基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,基因克隆至表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28a-Nsp9,转化BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为34.8 kD,表达量占菌体蛋白的40.32%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步制备抗Nsp9单抗及建立区分野毒和灭活毒感染的ELISA方法提供物质基础。

摘要：针对白细胞介素18(IL-18)基因和本实验室分离的PRRSVJL/07/SW毒株全基因序列,分别设计了2对特异性引物,扩增出IL-18基因和ORF6基因。将2个目的基因克隆于真核表达载体pEGFP-N1中,成功构建了重组真核质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6,阳性质粒转染Marc-145细胞进行筛选。通过表达载体在转染细胞中的高效转染,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)快速、准确的反映出阳性质粒在细胞质中的正确表达,再通过SDS-PAGE和Western blot鉴定构建的真核表达质粒pEGFP-IL18-ORF6的正确性。结果表明,ORF6基因和IL-18基因在Macr-145细胞中能有效表达。结论,所构建的真核质粒pEGFP-IL18-ORF6结构正确,能够在Marc-145细胞中高效表达,而且表达产物具有特异免疫学反应。

摘要：以猪附红细胞体和多种血营养菌16S rRNA基因的保守区设计合成引物HM-f/HM-r,在反向引物的5′端用生物素标记,以猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的可变区序列设计种特异性寡核苷酸探针,探针的5′端用地高辛标记,成功地建立了猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法。通过测定不同浓度PCR产物对应的微孔板杂交-酶反应显色OD值,用SPSS统计软件进行回归分析,得到回归方程为y=2.1012-0.4492×logx,其相关系数R为0.977,显示对未知样品可进行定量检测。该方法与猪的多种细菌性病原、猫血巴尔通氏体CA株和***无交叉反应,其敏感性比常规PCR琼脂糖电泳检测提高了近100倍。用建立的方法对38份临床样品进行检测,结果有12份检测结果为阳性。

摘要：从广东省棠下、增城等地区猪场送检病料中,分离到9株葡萄球菌,经TH-16S细菌生化编码系统鉴定表明,其中4株松鼠葡萄球菌,3株木糖葡萄球菌,2株猪葡萄球菌。参考Genebank中登录的基因序列,设计合成可区分4种猪葡萄球菌表皮脱落毒素ExhA、ExhB、ExhC、ExhD的引物,并以此引物对2株猪葡萄球菌和其余7株葡萄球菌进行了PCR检测,结果表明1株为ExhB型,1株为无毒力型,其余7株葡萄球菌均不能产生表皮脱落毒素,用此9株葡萄球菌回归动物后证实,ExhB毒力型的猪葡萄球菌致病力强,很快死亡;无毒力型的猪葡萄球菌无致病力;4株松鼠葡萄球菌都有不同程度的致病性;3株木糖葡萄球菌无致病力,说明猪渗出性皮炎的发生与猪葡萄球菌所产生的表皮脱落毒素有关。

摘要：从广东四会某猪场分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)的病毒,病毒在猪肾细胞上出现细胞变圆、拉网、融合等典型病变,并具有细胞泛嗜性特点。在MDCK细胞上测得其TCID50值为10-8/0.1mL,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。将0.1mL病毒液接种小鼠后发生奇痒并麻痹致死,接种猪3天后发病,7天死亡,从攻毒病死猪的脑组织病理切片上观察到典型的病毒性脑膜脑炎及血管套现象。通过PCR扩增到PRVgD基因,由此进一步证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为GDSH株。根据GenBank中发表的序列,设计一对扩增PRVgE基因的特异性引物,建立可以区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。以此方法对病毒的细胞培养液进行检测,结果证实所分毒株为PRV野毒株,经克隆测序后与GenBank收录的其它PRVgE基因序列进行比较,发现所测毒株的核苷酸序列与其它PRV毒株的同源性介于98.3%～99.9%之间,其中与PRVEa株的亲缘关系最近为99.9%。

摘要：本试验采用单因子随机试验设计,在玉米-豆粕型基础饲粮中添加不同水平(0、250、500、750、1 000 mg/kg)的胆碱,以研究饲粮胆碱添加水平对产蛋期绍兴鸭产蛋性能、蛋品质、生殖器官发育的影响,并探讨产蛋期绍兴鸭对胆碱的需要量。试验选用刚进入产蛋期的绍兴鸭540只,随机分为5组,每组6个重复,每个重复18只。试验期为20周。结果表明:1)饲粮中添加胆碱可显著提高产蛋期绍兴鸭的平均蛋重(P0.05)。2)饲粮胆碱添加水平显著影响蛋黄颜色和蛋壳厚度(P0.05);蛋壳厚度以500 mg/kg组为最大,显著大于0、750 mg/kg组(P0.05)。饲粮胆碱添加水平对蛋形指数、蛋壳强度、蛋白高度及哈夫单位均无显著影响(P>0.05),但蛋白高度及哈夫单位有随饲粮添加胆碱水平的升高而增大的趋势,而蛋形指数、蛋壳强度则以500 mg/kg组为最大。3)饲粮胆碱添加水平对绍兴鸭卵巢指数、输卵管长度指数、输卵管重量指数、优势卵泡总重/卵巢重量、优势卵泡总重量、优势卵泡数量均无显著影响(P>0.05)。由此可知,在玉米-豆粕型基础饲粮中添加胆碱可提高产蛋期绍兴鸭的平均蛋重,但会降低蛋黄颜色。综合考虑产蛋性能和蛋品质,在玉米-豆粕型基础饲粮中添加500 mg/kg胆碱即可满足产蛋期绍兴鸭对胆碱的需要量。

摘要：根据GenBank发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守区域的序列分别设计了2对特异性引物。建立了一种快速检测CSFV和PRRSV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测采集的临床疑似病料。结果表明,建立的CSFV、PRRSV-SYBR GreenⅠPCR有较好的特异性,敏感性和重复性,可以用于CSFV和PRRSV的检测。

摘要：根据GenBank中猪Ⅱ型圆环病毒 (PCV_2 )基因序列 ,设计两对特异性引物。将PCV_2广东分离株 (GD1株 )用PK15细胞系培养 ,从细胞培养物中提取病毒总DNA并以之为模板 ,用PCR方法分段扩增病毒全基因组 ,分别克隆到pMD18_T载体 ,对阳性质粒进行序列测定。用DNAstar对序列进行拼接 ,得到PCV_2GD1株基因组全序列 ,全长为 176 7个碱基 ,包涵 2个开放阅读杠 (ORF1和ORF2 ) ,分别编码与复制相关的Rep蛋白和结构蛋白Cap。通过BLAST对所测GD1株核苷核酸序列早国内外已登录GenBank中的PCV_2病毒核苷酸序更进行同源性比较 ,与PCV_2参考毒株的核苷酸同源性介于 94 4 %～ 99 7%之间 ,与德国株PCV_2 (AF2 0 1897)的同源性最高 ,为 99 7% ;与猪Ⅰ型圆环病毒 (PCV_1)参考株 (AY184 2 87)的同源性仅为 70 %。

摘要：根据柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)微线蛋白-2基因的cDNA序列设计-对特异性引物,以***广东株(EtGD)子孢子总RNA为模板,用RT—PCR方法成功扩增出EtGD微线蛋白-2(EtMic-2,GD)的cDNA序列。PCR产物连接到质粒pGEM—T—easy后,转化大肠杆菌DH5α。重组质粒经测序并与***北京株和豪顿株的MIC-2比较,开放阅读框架(ORF)核苷酸序列的同源性分别为99.70％(1023/1026)和99.61％(1022/1026),推导的氨基酸序列间分别有两个氨基酸不同,同源性为99.41％(340/342),经DNA sisst 1.02分析,这种差异可影响EtMic-2的抗原性。