摘要：背景:VEGF基因可促进脑缺血边缘区的血管生长,哪种导入途径的表达效果更理想值得探讨。目的:探讨脑池内及静脉导入rAAV-VEGF165基因对大鼠脑缺血边缘区血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达的影响,为VEGF基因治疗脑缺血提供实验依据。设计:析因设计。地点和对象:实验地点:深圳市人民医院动物实验中心;暨南大学医学院病理教研室。健康雄性SD大鼠48只,SPF级。干预措施:用线栓加环扎法建立SD大鼠持续性大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型。SD大鼠48只,随机分为脑脊液导入组、静脉导入组、梗死组和假手术组,治疗组于术后24h内将rAAV-VEGF165基因通过小脑延髓池或静脉内导入。各组分别取6只大鼠于术后7d和14d断头取脑,免疫组织化学染色检测VEGF的表达。主要观察指标:各组大鼠不同时间脑组织VEGF阳性细胞密度。结果:最终进入统计分析的大鼠保持为4组,每组12只,无缺失值。各组脑缺血边缘区VEGF阳性细胞密度(个/高倍视野,×400)分别为:7d组:脑脊液导入组74.90±2.33、静脉导入组36.27±2.61、梗死组24.27±1.69和假手术组5.65±0.47(P<0.05);14d组:脑脊液导入组95.03±1.55、静脉导入组69.17±4.29、单纯梗死组29.95±1.05和假手术组7.30±0.76(P<0.05)。结论:

摘要：背景:到目前为止,国内外对caspase 3抑制剂的研发大都集中在肽类或非肽类化合物的合成和发现上,而利用RNAi干扰技术直接沉默caspase 3基因,在基因水平抑制软骨细胞凋亡还未见报道。目的:利用慢病毒载体,把Caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使其caspase 3基因沉默,相对阻断凋亡效应的联级反应,期望达到抵抗软骨细胞凋亡的目的。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/2009-06在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所完成。材料:软骨细胞从SPF级SD大鼠关节中提取,caspase 3 siRNA慢病毒载体为实验构建。方法:构建大鼠pSIH1-H1-copGFP-Caspase 3 siRNA表达质粒,使用慢病毒包装系统,在293TN细胞中进行包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒,然后转导(transduce)入大鼠软骨细胞。主要观察指标:实时荧光定量-聚合酶链反应和Westernblot检测转导后软骨细胞caspase 3基因沉默情况,再用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡,流式细胞技术AnnexinV/PI检测软骨细胞凋亡情况。结果:Caspase 3 siRNA能顺利转入软骨细胞,转导率达90%;实时荧光定量-聚合酶链反应检测软骨细胞中Caspase 3mRNA的表达量,实验组低于与对照组差异有显著性(P<0.01);Western blot检测软骨细胞的Caspase 3蛋白表达量,实验组低于与对照组差异有显著性意义(P<0.01);在使用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡时,caspase 3 siRNA转导组抑制细胞凋亡的能力是对照组的7倍。结论:利用慢病毒载体把caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使软骨细胞的caspase 3基因沉默,可以达到相对拮抗软骨细胞凋亡的目的。

摘要：背景:间质干细胞的多向潜能性研究目前多处于动物实验阶段,至不同定位组织后是否有向其组织分化并产生相应的功能?目的:观察骨髓间质干细胞移植于脑皮质缺血性梗死灶的周围,观察其向神经分化及其对神经功能恢复的作用。设计:随机对照实验。单位:中山大学基础医学院解剖教研室,中山大学附属第一医院神经内科,暨南大学医学院病理教研室,广州医学院医学检验系。材料:实验于2002-11/2003-11在中山大学医学院完成。选择清洁级雄性SD大鼠48只,随机分为造模的梗死组32只和不造模的对照组16只。梗死组又随机分成移植组16只和磷酸盐缓冲液组16只;以前囟为参考点,尾侧3mm旁开1.5mm,深度2.0～3.0mm,分别移植5μL(5×104L-1)间质干细胞或磷酸盐缓冲液。方法:从非血液系统疾病的胸外科手术中摘取的肋骨骨髓中分离、纯化而获得的间质干细胞,经体外培养、扩增、鉴定。各组大鼠在移植后第2,6周末麻醉,对标本移植部位进行25μm连续冰冻切片。用免疫组织化学方法检测神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白的表达,评估间质干细胞向神经元、神经胶质细胞分化的能力。随机抽取移植组8只大鼠,磷酸盐缓冲液组8只大鼠,在移植前和移植后2,6周末用横木行走试验评分法观察大鼠全身状态和反应能力,对照组16只大鼠与移植组和磷酸盐缓冲液组同时测评。主要观察指标:①大脑皮质神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白的表达。②横木行走试验评定大鼠运动功能。结果:48只大鼠全部进入结果分析。①第2周末移植间质干细胞位置可见胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白表达呈现阳性。第6周末移植间质干细胞位置神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白表达也呈出阳性。而磷酸盐缓冲液组相应注射部位神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白表达均为阴性。②对照组无明显神经症状,评分均为9分。移植2周后,移植组运动功能评分高于磷酸盐缓冲液组犤(6.7±0.9)分,(5.3±1.0)分,(P<0.05)犦。移植6周后,移植组运动功能评分也高于磷酸盐缓冲液组犤(8.9±1.1)分,(7.2±0.8)分,(P<0.05)犦。结论:骨髓间质干细胞移植后在中枢神经系统有趋向神经元和神经胶质细胞分化的能力,表达了某些神经元胶质细胞的特性。移植组大鼠横木行走试验运动功能评分高于磷酸盐缓冲液组,并显示出明显的神经功能修复作用。

摘要：背景:研究表明,T淋巴细胞白血病的发生发展与Hedgehog通路的异常有关。Smo基因是该信号通路中的关键基因,控制着Hedgehog信号向细胞膜内的传递。目的:筛选一种可以高效抑制Molt-4细胞株增殖和诱导凋亡的小干扰RNA(Smo-siRNA)。方法:(1)根据siRNA设计原理,设计并化学合成Smo-siRNA 1,2,3以及无关干扰序列的阴性对照siRNA;(2)利用Nuclefector^(TM)核转染仪将以上Smo-siRNA分别转入人T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4细胞),分别在转染24,48,72 h采用qRT-PCR检测Smo mRNA相对表达水平,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态,流式细胞仪(Annexin V/PI法)检测细胞凋亡率。结果与结论:(1)利用Nuclefector^(TM)核转染仪成功将Smo-siRNA转入Molt-4细胞,Smo-siRNA 1沉默效果最佳,有效降低Molt-4细胞Smo mRNA表达水平(P<0.05),并且以48 h作用效果最明显;(2)转染后24 h,Smo-siRNA可明显抑制Molt-4细胞生长(P<0.05);(3)Hoechst染色证实Molt-4细胞符合凋亡的细胞形态学变化;(4)与对照组比较,Smo-siRNA1组细胞的凋亡率明显增加(P<0.05);(5)结果表明,小干扰RNA下调Molt-4细胞Smo基因表达可明显抑制Molt-4细胞增殖,并促进凋亡,提示Smo-siRNA具有作为T细胞白血病靶向基因治疗或者协同治疗的潜能。

摘要：背景：聚乙烯醇和海藻酸钠均为亲水性的聚合物，互溶性好，但其单独使用在材料的弹性和含水率等性能方面不理想。目的：制备聚乙烯醇-海藻酸钠-透明质酸组织工程支架，分析不同重均分子质量和醇解度的聚乙烯醇、不同质量分数的海藻酸钠、不同用量的透明质酸对材料含水率和膨胀率的影响。设计、时间及地点：对比观察实验，于2006—10／2008—03在广州暨南大学生物材料省重点实验室，教育部再生医学研究中心重点实验室完成。材料：聚乙烯醇，Mw14500，61500，为BS Chemical Technology产品，聚乙烯醇，Mw 88000，95000，为ACROS ORGANICS产品，聚乙烯醇-124，Mw24000，为广州市医药公司产品，透明质酸为美国Sigma公司产品，NaOH、CaCl2、海藻酸钠为国产分析纯。方法：将不同重均分子质量和醇解度的聚乙烯醇与不同质量分数的海藻酸钠、不同用量的透明质酸复合。主要观察指标：测定其复合材料的含水率和膨胀率，用扫描电镜观察材料内部的组织形态。结果：制备的聚乙烯醇-海藻酸钙-透明质酸复合材料平滑、柔韧，具有弹性。含水率为62．66％～86．64％，膨胀率为145．74％～324．45％。含水率和膨胀率随着聚乙烯醇重均分子质量和醇解度的增加而减小，随着海藻酸钠增加而增加，随着透明质酸的增加变化不太明显。扫描电镜结果提示材料随聚乙烯醇重均分子质量增加，材料中孔数减少。随醇解度增加，材料中孔数增多，分布均匀。随海藻酸钠增加，材料由片状结构变为蓬松的层状结构，孔洞逐渐增多。随透明质酸增加，材料孔洞数量增加，且孔径大小更均一，孔分布更均匀，材料由蓬松多孔结构转变为网状交织多孔结构。结论：聚乙烯醇Mw14500，醇解度98％形成的孔形态结构最好，含水率高，随海藻酸钠和透明质酸的加入，材料具有丰富的网状孔洞结构。

摘要：背景:聚乙烯醇是一种亲水性水凝胶物质,具有与人体组织相近的含水量和较高的机械强度,但细胞亲和性较差;糖胺聚糖和胶原是天然生物材料,能促进细胞生长,但单独使用时,机械性能较差。目的:观察胶原对聚乙烯醇-糖胺聚糖-胶原复合支架性能的影响。设计、时间及地点:多组对照选择,于2007-03/2008-06在广州暨南大学生物材料省重点实验室,教育部再生医学研究中心重点实验室完成不同配比设计的材料对照实验。材料:聚乙烯醇124(广州市医药公司),糖胺聚糖(BSChemical Technology),胶原(广州市红十字会医院创伤外科研究所,广州创尔生物技术有限公司),NaOH为国产分析纯。方法:聚乙烯醇、糖胺聚糖与0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05g胶原复合,制备聚乙烯醇-糖胺聚糖-胶原复合支架,测定复合支架的含水率、孔隙率和透光率。主要观察指标:不同胶原用量对复合支架含水率、孔隙率和透光率的影响。结果:①糖胺聚糖用量为0g和0.01g时,加入胶原,复合支架的含水率升高;而糖胺聚糖用量为0.03,0.05,0.07,0.09g时,含有胶原的复合支架含水率较不含胶原时下降。②含有胶原的复合支架,其孔隙率均比不加胶原时增大。③复合支架的含水率和孔隙率均随胶原用量增加而增加,但孔隙率在胶原用量为0.02g时出现最大值。④胶原的加入使复合支架的透光率下降,并且随着胶原用量的增加,透光率明显减少。结论:通过改变胶原在复合支架中的含量,能制备得到具有较高含水率、适宜孔隙率和透光率的聚乙烯醇-糖胺聚糖-胶原复合支架。

摘要：背景:体外培养软骨细胞经历多次传代后,其增殖能力将逐渐退化。实验表明,碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞增殖,并可能影响软骨细胞的表型与分化。目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对生长板软骨细胞增殖和分化的影响,并筛选其用于体外软骨细胞培养的最佳剂量。设计、时间及地点:以细胞为观察对象的观察对比实验,于2004-10/2005-02在暨南大学医学院生化教研室组织工程实验室完成。材料:选用12只新西兰白兔用于分离软骨细胞,碱性成纤维细胞生长因子由英国PeproTech公司生产。方法:分离并在低血清条件下培养兔生长板软骨细胞。根据实验需要加入0,1,2.5,5,10,25,50及100μg/L8个剂量的碱性成纤维细胞生长因子,进行各项指标观察。主要观察指标:应用改良四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞增殖倍数;应用羟脯氨酸法测定软骨细胞胶原产量;应用酶动力学方法测定碱性磷酸酶活性。结果:①碱性成纤维细胞生长因子剂量在5～100μg/L范围内可以促进软骨细胞增殖,并以25μg/L时刺激效果最为显著。②当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于25μg/L时,软骨细胞的胶原合成被抑制。③当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于1μg/L时,软骨细胞的碱性磷酸酶活性被抑制。结论:碱性成纤维细胞生长因子可以刺激生长板软骨细胞增殖,并在剂量高于25μg/L时抑制生长板软骨细胞的分化。

摘要：背景:以往制备骨关节模型的方法成模时间较长。目的:建立一个理想的兔膝关节软骨缺损动物模型。设计、时间及地点:随机分组设计,对照动物实验,于2007-03/2008-10在广州市红十字会医院创伤外科研究所完成。材料:用新西兰大白兔16只,雌雄不限,体质量3.2～4.0kg。方法:以6g/L戊巴比妥钠行耳缘静脉注射麻醉下,通过在实验兔后腿关节的股骨髁关节面部位用电动骨钻,在控制其直径4.5mm,深度为3mm,造成其关节软骨的缺损,制模后2,6,12,18周取出其股骨髁。主要观察指标:用大体观察、组织学染色共聚焦显微镜观察缺损部位软骨修复情况。结果:实验兔后腿关节的股骨髁关节面的关节软骨缺损后,在制模后2,6周缺损部位凹陷明显,只有少许肉芽组织和纤维组织生长填充,未见软骨细胞爬行生长,12,18周见缺损部位以纤维组织增生为主,底部及边缘可见骨组织和软骨增生,但是镜下形态仍与正常软骨组织区别较大,表面仍未见软骨细胞爬行生长。结论:实验建立的兔膝关节软骨缺损模型成模时间短,且缺损部位不能通过自我修复达到自愈。

摘要：背景:单纯的聚乙烯醇材料对细胞的黏附能力有限,用胶原蛋白对其进行表面修饰后能否改善其对细胞的黏附和增殖作用尚无公认。目的:探讨聚乙烯醇纺丝纤维编织用Ⅰ型胶原胶表面修饰后作为构建组织工程前交叉韧带支架材料的可行性。设计、时间和地点:对比观察实验,于2006-08/2007-10在暨南大学医学院第四附属医院,广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所完成。材料:Ⅰ型胶原蛋白胶,由广州市创伤外科研究所研制的胶原胶制剂。方法:用聚乙烯醇纺丝编织成条束状支架材料,用NIH-3T3细胞株和人前交叉韧带细胞体外培养、扩增后,分别种植到聚乙烯醇和经Ⅰ型胶原胶修饰过的聚乙烯醇纺丝纤维编织(PVA/COL)支架材料上,立体培养。主要观察指标:通过扫描电子显微镜观察NIH-3T3细胞株和人前交叉韧带细胞在聚乙烯醇与PVA/COL纺丝编织材料上生长及细胞外基质的分泌情况,对比评价编织构建的聚乙烯醇和经Ⅰ型胶原胶修饰过的聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料细胞相容性的优劣。在电子拉力机测试聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料力学性质,用SPSS11.5软件包分析材料的力学性能。结果:NIH-3T3细胞株和人前交叉韧带细胞在聚乙烯醇和经Ⅰ型胶原胶修饰过的聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料表面和孔隙内黏附增殖并能分泌细胞外基质。NIH-3T3细胞株比人前交叉韧带细胞生长旺盛。NIH-3T3细胞株和人前交叉韧带细胞在经I型胶原胶修饰过的聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料上细胞黏附数量明显增多,在聚乙烯醇支架材料上细胞生长形态较好。I型胶原胶可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质但对人前交叉韧带细胞作用不明显。拉力测试该编织材料负荷-拉伸曲线与人及兔前交叉韧带的相似,柔韧性好,最大负荷、极限应力和弹性模量分别为52.61N,14.96MPa和202.08MPa。结论:Ⅰ型胶原可促进NIH-3T3细胞株和人前交叉韧带细胞在聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料表面和孔隙内黏附、增殖,可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质,聚乙烯醇纺丝纤维编织材料具有一定的力学性能和良好的细胞相容性。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存在怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用。设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300g6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型。方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用。取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组。主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况。大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平。结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后,部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞呈节律性跳动,呈心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性。对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变,其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性。结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟。