摘要：目的 建立一种基于通用多重不对称聚合酶链反应(PCR)联合基因芯片的下呼吸道病原菌及耐药基因检测方法,同步实现6种下呼吸道常见病原菌(大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌)和两种碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaVIM)快速检测。方法 针对待检病原菌及耐药基因的保守序列设计特异性引物与探针,并制备相应的基因芯片。优化多重PCR的反应体系和杂交参数,分析其特异度、灵敏度,并通过临床标本进行方法应用评价。结果 本研究建立的检测方法特异性强、稳定性好,能在4 h内特异性地鉴别单一或多重靶标。检测大肠埃希菌纯培养物的灵敏度为104copy/mL,鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌及碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaVIM)的灵敏度均为103copy/mL,金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌的灵敏度均为102copy/mL。与产酸克雷伯菌、黏质沙雷菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、唾液链球菌、流感嗜血杆菌等6种病原菌无交叉反应。结论 基于通用多重不对称PCR结合基因芯片的下呼吸道病原菌及耐药基因检测方法特异性强、灵敏度高,为快速、灵敏地鉴定下呼吸道病原菌及耐药基因提供了一种有效的检测手段。

摘要：目的:通过化学方法设计合成得到唑吡坦的半抗原及其人工抗原。方法:唑吡坦小分子连接上经化学修饰的连接臂,并使用碳二亚胺法与载体蛋白偶联合成唑吡坦人工抗原,并通过质谱分析、紫外吸收光光谱扫描技术、SDS-PAGE电泳法及胶体金免疫层析法对抗原进行偶联效果和抗原活性的鉴定。结果:通过上述分析测试,方案中唑吡坦半抗原结构合成成功,并与载体蛋白偶联得到人工抗原;通过临床样本验证,该抗原具有较高的活性,与唑吡坦抗体反应表现出较高的特异性。结论:该方法合成的唑吡坦抗原可用于免疫检测方法,也可作免疫原制备相关抗体。

摘要：目的:探讨乙型肝炎病毒e抗原基因在大肠杆菌中进行高效融合表达,并对表达条件进行优化和影响因素的分析。方法:从乙肝患者阳性血清中提取DNA,设计引物扩增目的基因,按常规方法克隆入pET-GST载体谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导目的基因片段的表达,经超声处理后SDS-PAGE电泳。对表达条件进行正交试验优化,并分析其影响因素的大小。结果:HBeAg以包涵体形式表达出来,其表达的GST融合蛋白的分子质量大约为44KD。最佳的表达条件为温度为30℃,IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为2h。其影响因素大小依次为诱导温度>诱导时间>IPTG浓度。结论:乙肝e抗原基因在大肠杆菌中获得了高效表达。

摘要：目的:通过人工合成HIV-1整合酶(integrase,IN)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达。方法:根据IN的氨基酸序列,选择大肠杆菌偏好的密码子,设计并合成了877碱基,共编码288个氨基酸,克隆入pMD18-T载体,经测序证实后,构建原核表达载体pET-His-p31,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果:酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量为32kDa的位置出现明显目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的65.9%,Western blot结果表明表达的聚合酶蛋白能与HIV-1阳性血清发生特异性反应。结论:已获得高效表达工程菌pET-His-p31,为下一步研究HIV诊断试剂奠定基础。