摘要：目的建立检测创伤伤口分泌物中产气荚膜梭菌的实时荧光定量PCR方法,为气性坏疽的早期快速诊断提供新手段。方法以产气荚膜梭菌16SrDNA基因序列为模板,在其保守区域设计特异性引物及探针,以PCR扩增产物重组质粒作为定量检测的标准品,绘制标准曲线。对荧光定量PCR体系和反应条件进行优化,并验证方法的特异性、敏感性、重复性及临床应用的可行性。结果所建立方法检测产气荚膜梭菌具有高度特异性,与创伤弧菌等23种相关细菌均无交叉反应。检测灵敏度以纯菌计达9×102cfu/ml,相当于9cfu/反应。反应体系具有很高的稳定性。整个操作过程仅需3h。5例创伤可疑分泌物样本的荧光定量PCR检测结果与细菌培养完全一致。结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可用于创伤伤口分泌物中产气荚膜梭菌的日常检测以及战时和突发事件时的批量应急诊断。

摘要：目的研制联合诊断HBV、HDV、HCV及HCV分型的寡核苷酸（Oligo）芯片，并进行系列优化及临床应用性研究。方法从GenBank数据库获取HBV全长DNA序列，HDV及HCV4个基因型全长cDNA序列，根据BLAST分析结果获得HBV、HDV种属保守序列及HCV各型特异性序列，以作为设计Oligo探针的备选序列。用Array designer 3．0分别对BLAST检索所得的HBV、HDV种属保守序列和HCV型特异性序列逐一进行分析，设计长度均一的60mer Oligo探针。从HBV、HDV、HCV种属保守序列和HCV型特异性序列中分别挑选出16、8、68条60 mer Oligo探针。Oligo探针合成和纯化后，用芯片打印仪固定在玻片上。为便于研究，先后制备了2种芯片，包括HBV、HDV诊断芯片、HCV分型芯片。采用限制性显示PCR技术进行样品荧光标记后与芯片杂交，并根据杂交结果筛除了有非特异杂交和信噪比低于4．0的探针，选取高特异的探针制备了HBV、HDV、HCV联合诊断分型芯片。结果从杂交效果来看，研制的Oligo芯片特异性较高，可有效用于HBV、HDV、HCV的联合诊断及HCV的分型。为了适应临床诊断的要求，对芯片进行了实验条件摸索和一些优化，均取得较好的效果。结论制备的肝炎病毒诊断分型芯片检测敏感性、特异性均佳，具有较为广阔的应用前景，为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备。

摘要：目的设计保证临床质量要求的凝血试验室内质控规则。方法以卫生部检验中心室间质评结果计算偏倚Bias,以连续4个月的室内质控测定CV为方法的不精密度,CLIA8'8能力比对检验评价限为总允许误差TEa,利用OP-Specs图,选择凝血试验项目的室内质控规则。结果一批测定两个浓度的质控品,凝血酶原时间PT、部分凝血活酶时间APTT和纤维蛋白原Fib的室内规则分别为1_3s/10x、4_1s、1_3s/10x。结论质控性能均达到误差检出率大于90%且假失控率小于5%,质量控制符合临床质量要求。

摘要：目的:建立特异、敏感、快速检测西尼罗河病毒(WNV)的SYBR Green实时荧光定量PCR方法。方法:针对西尼罗河病毒囊膜蛋白(E)的保守序列设计引物,建立WNV的实时荧光定量检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性以及稳定性。对保存的54例WNV感染者的血清样本进行检测,分析其检测的准确性。结果:建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法对WNV的检测具有高度的特异性,而对日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)等均无交叉反应,检测的灵敏度可达到100pg。标准曲线具有较好的线性关系,相关系数为0.995,实时荧光定量PCR效率为100%。对54例WNV感染样本进行检测,准确率高达98.15%。结论:实时荧光定量PCR技术检测WNV具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可作为临床诊断WNV的手段。

摘要：目的利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的产气荚膜梭菌检测方法。方法以产气荚膜梭菌基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以产气荚膜梭菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的灵敏度、特异性、重复性。结果反应体系在上、下游引物浓度均为1μmol/L,探针浓度为0.1μmol/L时,具有良好的特异性和灵敏度,与创伤弧菌等24种相关细菌均无交叉反应,对纯菌检测的灵敏度为9×102CFU/ml,重复性试验证实该体系重复性好,稳定性高;3例临床样本检测结果与细菌培养结果相符。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对临床气性坏疽做出快速准确的报告,实现对气性坏疽战时高发性疾病安全、快速和定量检测。

摘要：目的拟靶向细胞内一群重要的信号转导因子—激酶,利用CRISPR/Cas9技术构建真核细胞敲除文库质粒,并探讨其构建方案。方法拟靶向编码人源激酶蛋白的507个基因开放阅读框,针对每个基因片段设计10个作用靶点,通过芯片法合成引物库(oligo pools)后,将引物从芯片上洗脱下来;合成的引物模板序列经PCR扩增、割胶回收后,与Cas9慢病毒载体连接,电转化至感受态细胞并提取质粒;质粒转化至Stbl3感受态细胞后,随机挑取单克隆进行摇菌,并送测序。结果 (1)对选取的507个激酶基因进行GO分析,发现细胞激酶广泛参与各种重要的细胞信号通路;(2)以oligo pool为模板,利用合成的通用引物进行PCR扩增,得到大小约为140 bp的条带,符合预期;(3)在鉴定的40个文库质粒克隆中,共有34个克隆样品测序成功,其中25个样品与设计的目标序列完全一致,9个样品存在一定引物合成突变。部分克隆存在摇菌失败、测序无信号或双峰等因素。结论构建好的CRISPR/Cas9激酶敲除文库可广泛用于筛选介导细胞增殖、转移、耐药、自噬等表型的重要激酶,为阐明激酶在疾病发生发展中的作用奠定基础。

摘要：目的观察疱疹病毒2型潜伏相关转录子开放阅读框架(HSV-2 LAT ORF)在病毒潜伏感染激活中的作用。方法体外建立HSV-2潜伏感染及复发的神经细胞模型,对病毒在细胞中的潜伏和激发进行PCR验证及测序;设计针对LAT ORF的siRNA,激活诱导后转染SH-SY5Y细胞,检测转染前后LAT ORF的表达改变;制备HSV-2基因表达谱芯片,利用芯片分析抑制LAT ORF后病毒基因表达的改变。结果在人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y上成功建立了HSV-2潜伏感染及激活的细胞模型,LAT、gG基因PCR扩增及电泳结果证实了病毒在细胞中的潜伏及激活;LAT ORF-siRNA转染细胞24、36、48h后,LAT ORF mRNA的表达水平分别降低了39%、51%和60%。基因芯片分析干扰后病毒基因表达,共有28个基因出现差异表达,其中24个基因下调,4个基因上调。结论 LAT ORF在HSV-2潜伏感染激活中发挥了重要作用,为下一步分析LAT在病毒潜伏激活中的调控机制奠定了基础。

摘要：室内质量控制(简称室内质控)是由实验室的工作人员采用一系列统计学方法,连续地评价本实验室测定工作的可靠程度,判断检验报告是否可发出的过程.室内质控的目的是检测、控制本实验室测定工作的精密度,通常要求室内质控规则的误差检出概率(Ped)达90%以上,而假失控概率(Pfr)在5%以下.上世纪90年代,Westgard提出了评价质控规则的功效函数图和操作过程规范(OPSpecs)图,可以通过不同的随机误差和系统误差水平估计失控概率(Pfr和Ped),从而进一步来描述和比较不同质控方法的性能特征,使实验室所设计的质控方法保证常规分析达到规定的质量水平,并预测测定方法的质量[1].我们应用OPSpecs图,结合全国室间质评,分析本科室内质控方法.

摘要：目的探讨雷米芬太尼和(或)丙泊酚对离体静脉血中性粒细胞(PMNs)存活率的影响。方法取健康成人志愿者静脉血,乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝。采用正交实验设计,确立因素为雷米芬太尼和丙泊酚;研究分为五组,选用正交表L25(56),以观察药物对静息状态和脂多糖(LPS)激活状态PMNs 24 h存活率的影响,根据用药时机的不同又分为预防性用药和治疗性用药。流式细胞仪检测其24 h存活率。结果(1)静息状态下,50和500 ng/ml雷米芬太尼增加PMNs的存活率(P<0.05),丙泊酚各组及其溶媒对照组对PMNs的存活率没有影响。(2)LPS激活状态下,预防性应用50和500 ng/ml雷米芬太尼可明显增加PMNs的存活率,而治疗性应用仅50 ng/ml雷米芬太尼组增加PMNs存活率(P<0.05);预防性或治疗性应用丙泊酚和其溶媒可明显降低PMNs存活率(P<0.01),但丙泊酚各组与溶媒对照组间比较差异无统计学意义。(3)雷米芬太尼和丙泊酚对静息或LPS激活状态下PMNs存活率的影响没有交互作用;预防性或治疗性应用雷米芬太尼和丙泊酚对LPS激活状态下PMNs存活率的影响也无交互作用。结论雷米芬太尼和丙泊酚对PMNs 24 h存活率的影响与其用药时机和PMNs所处的状态有关,丙泊酚对LPS激活的PMNs 24h存活率的影响似乎是其溶媒脂肪乳作用所致。雷米芬太尼和丙泊酚对静息或LPS激活状态下PMNs 24 h存活率的影响没有交互作用。

摘要：目的制备病毒性肝炎联合诊断cDNA芯片,并进行系列优化及临床应用性研究。方法对于基因组较小的HBV、HDV病毒,采用PrimerPremier5.0软件针对其保守区域设计特异引物,普通PCR技术制备探针;利用限制性显示PCR(RD-PCR)技术制备基因组较大且复杂的HCV芯片探针。为了便于摸索实验条件和更好地进行探针优化,先后制备3种芯片,包括HBV与HDV诊断芯片、HCV诊断芯片及HBV、HDV、HCV联合诊断芯片。结果杂交结果显示HBV与HDV诊断芯片、HCV诊断芯片的诊断效果较为满意。从以上2种芯片中选取探针制备HBV、HDV、HCV联合诊断芯片,并对该芯片的检测质量进行初步评估:①检测线性:病毒质粒拷贝数在104～1011copies/ml之间时,芯片检测法显示了较好的线性(r分别为0.9902、0.9921、0.9819,P<0.01);②特异性:检测黄热病病毒(YFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、登革热病毒(DV)等其他病毒样品结果均为阴性,说明该芯片特异性较好;③重复性:检测HBV、HDV、HCV的批内精密度变异系数(Cv)值为7.1%、7.2%、6.6%,批间精密度Cv值为7.9%、8.2%、7.6%;④准确性:将HBV、HDVPCR片段(共14条)、HCV限制性片段(24条)和部分临床阳性血清(PCR产物)全部进行序列测定,在GenBank中进行Blast比较,结果表明克隆基因均属于相应基因,与理论一致。为了适应临床诊断的要求,对实验条件进行优化,包括减少杂交时间、取消预杂交、将杂交温度提高到52℃等措施。在实验室对芯片进行初步评估后,对临床血清标本进行小规模批量检测实验:用芯片法和实时定量PCR法检测HBV阳性血清(98例)、HCV阳性血清(42例)和阴性血清(130例),对两种方法进行对比,结果显示芯片法检测与实时定量PCR法有良好的相关性(HBV、HCV的r值分别为0.9854和0.9582),检测HBV、HCV、HDV的敏感性和特异性分别为85.7%、76.2%、80.0%和96.7%、95.0%、100%。结论本研究研制的联合诊断芯片敏感性、特异性均较佳,临床应用前景较好。