摘要：目的针对水体中常见的硅藻、蓝藻和气单胞菌,设计相应引物,采用qPCR方法进行检测,验证该方法的特异性和检测灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计与溺死相关的浮游生物特异引物ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD;扩增20种浮游生物标准株DNA以确定其特异性和灵敏度;检测38只实验兔的肺、肝、肾组织的样本,计算设计的6对引物扩增产物的总体检测阳性率,并与相应的硅藻电镜检验结果对比,验证所建立方法诊断溺死的有效性。结果ND、UPA两对引物能特异扩增硅藻属,CBR能特异扩增蓝藻属,AER、HLYA、rPOD能特异扩增气单胞菌属;以上6对引物扩增产物均能达到0.0001ng的检测灵敏度。实验兔的qPCR检测结果显示,16只溺死兔肺组织均为阳性,且分别有13例肝和14例肾呈阳性,总体诊断阳性14例,阳性率可达87.50%;16只死后浸泡兔和6只空白对照兔中,只有5例死后浸泡兔的肺组织检出阳性,其余皆为阴性。电镜结果显示,16只溺死兔的肺、肝、肾均为阳性,16只死后浸泡兔和6只空白对照兔中,只有5例死后浸泡兔的肺组织电镜检出硅藻阳性,其余皆为阴性,与qPCR结果相一致;经统计学分析,上述两种方法对38只实验兔的总体诊断结果差异没有统计学意义(P=0.49>0.05),对38只实验兔的所有肺、肝、肾样本检测的诊断阳性率差异没有统计学意义(P=0.29>0.05)。结论上述6对引物结合qPCR检测方法进行溺死诊断,具有较高的灵敏度,且特异性较好,具有良好的应用前景。

摘要：针对复杂背景的藻类图像较难进行图像分割,难于识别的问题,提出一种基于复杂背景和高分辨率电子显微镜的小环藻识别方法。对藻类图像进行切片处理,以藻类中心为原点进行极坐标变换,得到无复杂背景干扰的感兴趣区域ROI(region of interest);对ROI提取局部二值模式、主成分分析系数、熵、Hu矩、互信息和结构相似度等特征;用获得的特征训练C4.5决策树并对不同藻类图像进行识别处理。实验结果表明,所提方法能够有效识别复杂背景下高分辨电镜的小环藻。

摘要：目的利用绿藻ChlB基因和蓝藻NIES基因,建立聚合酶链反应-毛细管电泳(polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE)检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法针对GenBank中绿藻ChlB基因和蓝藻NIES基因的保守序列,设计特异性引物ChlB和引物NIES,以此构建PCR-CE检测方法。扩增50种标准样本DNA。阳性标准样本梯度浓度检测,确定灵敏度。检测25例尸体肺组织样本(溺死20例,自然死亡5例),同时比较微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法(microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy,MD-VF-Auto SEM)的同步检测结果。结果引物ChlB和引物NIES最低检测DNA含量分别为0.161、0.109ng,可分别特异性扩增水体广泛存在的绿藻(蛋白核小球藻)和蓝藻[铜绿微囊藻(产毒及不产毒)],产物片段分别为156、182bp,非溺死器官组织检测结果均为阴性。结论构建的方法灵敏度高、特异性好,能很好地应用于溺死相关浮游生物检测,与MD-VF-Auto SEM法联用,可以增大溺死相关浮游生物的检测范围,提高溺死诊断的证据力。

摘要：目的建立溺死尸体脏器气单胞菌气溶素(aerA)和溶血素(hlyA)两基因的PCR-CE检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计气单胞菌(Aeromonas)特异性引物aer-A1和hlyA-1,构建PCR-CE方法;扩增52种标准株DNA;确定最低DNA检测浓度;检测16只实验猪和40例真实案件尸体组织样本,分别计算两对引物总阳性率。结果引物aerA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌,产物片段为180bp,灵敏度分别为0.034、0.92ng;引物hlyA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌,产物片段为150bp,灵敏度分别为0.94、0.034ng。利用aerA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为70.00%、78.38%;利用hlyA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为80.00%、83.78%。结论基于气单胞菌aerA基因和hlyA基因建立的PCR-CE检测方法进行溺死诊断,快速灵敏,特异性好,有良好的应用前景。

摘要：目的建立硅藻UPA条形码基因的实时荧光定量PCR检测方法,探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法对Gene Bank中登录的硅藻UPA基因序列进行比对获得同源序列,据其设计硅藻门通用引物。对2种人体常见共生菌(大肠杆菌、双歧杆菌)、3种浮游细菌、15种浮游藻类、32具尸体(其中生前溺水死亡28例,死后抛尸1例,陆地死亡3例)的组织样本(肺、肝、肾)及尸体发现地水样提取DNA,采用设计的引物进行特异性、灵敏度、重复性试验,分析检材中硅藻检出情况,统计硅藻阳性率,以上述组织样本的微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法检测结果对建立的q PCR检测方法进行比较评估,比较该方法与PCR-毛细管电泳检测法的灵敏度。结果引物UPA99仅对硅藻标准株(针杆藻、舟形藻、直链藻、小环藻、菱形藻)DNA具有扩增,扩增产物熔解曲线平稳,峰尖且窄,熔解温度为(87±1)℃。以p MD18-T重组质粒为标准品,检测区间为1.56×10~2-1.56×10^(-5)ng/μL,建立实时q PCR方法的灵敏度为1.56×10^(-5)ng/μL,而PCR-CE方法的灵敏度为1.56×10-3ng/μL。批间及批内变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。对于生前溺水尸体肺、肝、肾的检出率依次为89.3%,71.4%,64.3%。结论基于硅藻UPA基因设计通用引物,建立的q PCR硅藻检验法特异性高、灵敏度高、重复性好,应用于溺死诊断具有较好的应用前景。

摘要：目的构建溺死相关浮游生物基因座的复合扩增体系,验证体系特异性并评估其在法医溺死诊断中的应用价值。方法针对溺死相关浮游生物同源基因序列,设计特异性引物,并用FAM、HEX、TAMRA、ROX、SIZ荧光染料分组标记,构建复合扩增体系;进行体系特异性验证;以16例实验猪样本评估体系检验效能;复合扩增体系、硅藻形态学MD-VF-Auto SEM检测法及硅藻rbc L基因PCR-CE检测法分别检测28例案件样本,比较分析应用效果。结果该复合扩增体系共包含14个基因座,可特异性扩增35种浮游藻类和3种浮游细菌,人、3种人体共生菌及8种浮游细菌均为阴性。以该体系检测溺死实验猪,阳性率为90%,非溺死实验猪均未检出;检测溺死案件样本,阳性率为96%,非溺死案件均未检出。复合扩增体系与MD-VF-Auto SEM法检测案件尸体肺、肝和肾的阳性率均不具有统计学差异(P>0.05),但其与硅藻rbcL基因PCR-CE法检测案件肝和肾的阳性率均具有统计学差异(P<0.05)。结论本文针对多种溺死相关浮游生物14个基因建立的复合扩增体系,具备多种靶物种的特异性遗传标记,且所需检材量小,提高了检测效能,在法医溺死鉴定中具有良好的应用前景。