摘要：目的建立一种可单管同时检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和人源基因内标的一步法多重巢式荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法。方法收集2020年2月至2022年2月广州白云机场海关入境人员新型冠状病毒核酸阳性样本30份和336份排查样本,以及2020年发生新型冠状病毒肺炎疫情前3年期间同样来自广州白云机场海关入境人员的其他呼吸道病原体阳性样本64份和呼吸疾病国家重点实验室提供的呼吸道病原体阳性毒株7份。选取新型冠状病毒ORF和N基因,以及甲、乙型流感病毒M基因的核苷酸保守区域,设计和筛选出多重巢式荧光PCR引物和探针组合,同时引入人源基因内标的巢式扩增引物和探针,建立一套多重巢式荧光RT-PCR检测方法,应用制备的假病毒阳性质控品和样本盘,评估方法的敏感度、特异度,并进行临床样本应用性验证。结果所建立的一步法多重巢式荧光RT-PCR方法可特异性检出新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒,新型冠状病毒的最低检出限约为125拷贝/ml,甲、乙型流感病毒的最低检出限约为250拷贝/ml;检测101份各类呼吸道病原体阳性样本,显示新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒的检测敏感度分别为96.67%、92.86%和96.15%,三者的特异度均为100%,超过300份临床样本的应用性检测中,未见假阳性检出。结论建立了一套新型冠状病毒、甲、乙型流感病毒和人源基因内标的一步法多重巢式荧光RT-PCR方法,该方法具有良好的灵敏度和特异性,可用于新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒的大批量样本快速筛查。