摘要：玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp. stewartii,Pss)是我国进境植物检疫性有害生物。根据Pss与其近似种序列差异,设计特异性引物PS3F/PS3R和探针PS-3P,建立Pss实时荧光PCR检测方法。测试结果显示,供试的6株Pss菌株均有阳性扩增,其他74株供试菌株和空白对照均为阴性扩增,菌体DNA的检测低限为13 fg;对模拟带菌玉米种子进行实时荧光PCR检测并建立标准曲线,R2=0.998 8,线性关系良好。本文建立的实时荧光PCR检测方法可为口岸检疫提供一种准确快速检测方法。

摘要：为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)Taq Man荧光定量RT-PCR方法,本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和Taq Man探针,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估。结果显示,该方法特异性强,与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应。建立的标准曲线的R^(2)为0.999,扩增效率为102.096%,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当,是常规RT-PCR的100倍;采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品。建立的Taq Man荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测。

摘要：目的研制一种能够用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌(以下简称单增李斯特菌)的质粒DNA标准物质。方法设计一种质粒DNA包含目前常用于单增李斯特菌检测的hlyA、plcB、inlA基因,并对其稳定性、均匀性和量值可追溯性进行评价。评估其在实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测中的适用性。结果质粒DNA参考物质的最终定值结果为29.85μg/mL。该质粒DNA参考物质量值可靠,均匀性和稳定性良好,可以在-20℃下保存1年以上。质粒DNA参考品在实时荧光PCR检测中的适用性证明,可以保证实时定量PCR检测结果与单增李斯特菌基因组DNA参考品具有可比性。结论研制的质粒DNA标准物质可以替代单增李斯特菌基因组DNA对单增李斯特菌进行质量监控,满足单增李斯特菌检测在实验室质量的有效控制和试验方法验证的需要。

摘要：为了快速、准确地鉴定番茄斑萎病毒,根据GenBank中韩国的番茄斑萎病毒株系(序列号:KC261961)ssRNA-S基因组编码保守外壳蛋白基因序列设计特异性引物TSWV 5F/5R,建立了番茄斑萎病毒RT-RPA检测方法。特异性检测结果表明,仅番茄斑萎病毒样品扩增出215 bp目标条带,而其他4种病毒样品无扩增出目标条带。灵敏度检测结果表明番茄斑萎病毒RPA检测方法可以达到10-5 cDNA稀释度。

摘要：南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,SBMV)是我国进境植物检疫性病毒,可随豆类种子远距离传播。本研究针对SBMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计特异引物组,建立了一种反转录(reverse transcription,RT)交叉引物扩增(cross-priming amplification,CPA)快速检测方法,并分别结合实时荧光和侧向层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测扩增产物构建了实时荧光RT-CPA和RT-CPA-LFD体系。结果显示,所建立的针对SBMV的RT-CPA检测方法特异性强,以其他4种可随豆类种传的植物检疫性病毒为对照,均无交叉反应。其中,实时荧光RT-CPA和RT-CPA-LFD检测SBMV灵敏度分别达5×10^(-4)ng/μL和5 ng/μL。所建立的RT-CPA检测SBMV方法具有快速、准确、可视化等优点,在口岸检测中具有良好的应用前景。

摘要：采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统,建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列,选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物,并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化,建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取105~1 copies·μL^(-1)含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明,本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏,其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL^(-1))2.0μL、crRNA(100μmol·L^(-1))3.2μL、TaqMan探针(50μmol·L^(-1))1.28μL、T7 RNA Polymerase 0.25μL、NTP Buffer Mix 2.0μL。该方法检测灵敏度可达1 copy·μL^(-1),且与AIV H3、H6、H7、H9、H10亚型以及NDV、IBV、IBDV、DTMUV无交叉反应。对56份已知的临床样品进行检测,检测结果与荧光定量RT-PCR符合率为98.2%。综上,本研究通过RT-RAA等温扩增技术结合CRISPR-Cas13a基因编辑技术建立了针对AIV H5亚型的快速检测平台,该方法从样本的核酸抽提到获得检测结果的时间控制在1 h 20 min以内,为AIV H5亚型高灵敏度和高特异性的临床快速检测提供了新的技术手段,具有良好的应用前景。

摘要：本研究根据塞内卡谷病毒(SVV)基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测SVV的实时荧光RT-PCR法。结果表明,该法特异性强,能准确检测SVV核酸,与其他几种相似疾病病原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测核酸浓度为7.2×10^-5μg/mL;重复性好,Ct值批内和批间变异系数(CV)均小于3%。利用所建立方法对116份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于SVV的临床检测和流行病学调查,为有效防控塞内卡病毒病提供技术支撑。

摘要：2021年6月初,我国报道了全球首例H10N3亚型禽流感病毒感染人的事件,该亚型病毒具有跨宿主感染人类的能力,对社会公共卫生安全形成潜在的重大危害,因此,亟须建立一种快速、简便、适用于实验室的H10N3亚型禽流感病毒核酸检测方法。将自GISAID下载的H10N3亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列进行分析比对后,根据其保守区域设计并筛选出2对特异性检测引物,分别对引物浓度、核酸浓度、退火温度、循环数等进行优化,以确定最佳反应条件,建立禽流感病毒H10N3亚型一步法双重RT-PCR检测方法。结果显示,该方法可分别扩增出407 bp和602 bp禽流感病毒H10基因和N3基因的特异性条带,且不与H1N1、H3N2、H6N6、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒以及NDV、IBV、IBDV、DTMUV发生交叉反应。该方法灵敏度高,最低检出限为900 pg。在对36份已知的临床样品的检测中,H10N3亚型禽流感病毒阳性率为2.78%,与禽流感H10Nx基因型、Hx N3基因型一步法RT-PCR检测方法以及病毒分离鉴定结果一致,符合率均为100%。上述结果表明,本研究建立的一步法双重RT-PCR方法可以在一次PCR反应中检出H10与N3亚型禽流感病毒混合感染或者单一感染样品,为兽医工作者开展H10N3、H10Nx和Hx N3亚型禽流感的临床诊断和流行病学监测提供了一种简单、有效的分子生物学快速检测方法。

摘要：通过比对NCBI上马流感H3N8序列,针对HA和NA基因序列高度保守区域设计了特异性强的引物与探针,优化了程序,建立了以实时荧光RT-PCR技术检测马流感H3N8的方法。结果表明,该方法最小检测浓度为3.36×10^2copies/μL;特异性强,仅针对马流感H3N8样本检出为阳性;对58份临床样本的检测,阳性检出率为12.07%,是常规PCR的2.3倍,且与病毒分离100%符合。