摘要：为了建立一种能够同时鉴别H5、H7、H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎6种鸡病毒性呼吸道传染病病原体的GeXP检测方法,本研究根据这些病原体各自的基因保守序列,设计合成了7对特异性引物,优化反应条件,用单一病毒、混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性和准确性,以不同拷贝数的克隆质粒来检测GeXP方法的灵敏度。检测34份临床阳性样品,进一步验证该法的可靠性。结果显示,在7对引物同时存在的GeXP反应体系中,可特异性地扩增出相关6种病毒目的片段,并可在102拷贝/μL水平同时特异地检测出鸡6种病毒性呼吸道传染病,GeXP方法检测34份临床阳性样品结果与病毒分离一致。本研究建立的GeXP方法不仅可高通量检测6种病原体,而且具有特异性强和灵敏度高的特点,适用于临床样品混合感染的快速鉴别诊断,对这6种发病特征及临床症状相似的鸡病毒性呼吸道病的有效防控有很高的实际应用价值。

摘要：为建立一种能鉴别鸡毒支原体强弱毒株的快速检测方法,根据GenBank中鸡毒支原体S6株的16SrRNA基因序列和F弱毒疫苗株假定的α磷酸海藻糖酶基因序列,设计2套环介导等温扩增引物,建立了鸡毒支原体强弱毒株的环介导等温扩增可视化鉴别检测方法。该方法的敏感性可达10fg,是常规PCR方法的100倍,对其他鸡常见病原体的检测结果均为阴性。全部反应只需一个可控温的水浴锅在1h内即可完成,通过肉眼观察颜色直接判定结果。本研究建立的环介导等温扩增方法简便、快速、灵敏、特异,是一种适于基层工作站的鸡毒支原体强、弱毒株鉴别检测方法。

摘要：为建立能够快速检测鸡滑液支原体(MS)的检测方法,本研究根据GenBank中MS热休克ATP依赖蛋白酶基因的保守序列,设计了一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了MS的LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达102拷贝DNA,高于常规PCR方法 10倍;全部反应可以在1 h内完成;可以通过肉眼观察钙黄绿素颜色变化直接判定结果;对其它常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可以用于MS感染的快速检测。

摘要：为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2条探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法。该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小。本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路。

摘要：本研究旨在建立一种能同时检测(H5、H7、H9)亚型禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和副鸡嗜血杆菌共9种鸡呼吸道传染病病原体的GeXP高通量检测方法。根据GenBank中这9种病原体的基因保守序列,设计了10对特异性引物。用所建立的GeXP多重PCR方法对单一、混合病原体进行检测,验证多重反应体系的特异性和准确性,以含靶基因的质粒来检测多重反应体系的灵敏度,并对38份阳性样品进行检测。该法能特异性检出9种鸡呼吸道病病原体,并可在1×102 copies/μL水平同时特异地检测出9种病原体,38份阳性样品的检测结果与实际相符。本研究建立的同时鉴别9种鸡呼吸道病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强、灵敏度高的特点,为同时鉴别这9种临床症状相似的疾病提供了新型检测方法。

摘要：为建立能快速检测猪蓝耳病病毒(PRRSV)的检测方法,本研究根据基因库中PRRSV非结构蛋白NSP2基因的保守序列,设计了一套特异性环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立了PRRSV的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10 copies RNA,高于常规PCR方法 10倍;全部反应可以在50 min内完成;可通过肉眼观察钙黄绿素(calcein)颜色变化直接判定结果;对其它常见病原体的检测结果均为阴性,同时应用实时浊度仪对反应体系浊度及浊度的变化速率进行实时测量,结果相一致。结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于PRRSV感染的快速检测。

摘要：【目的】建立可视化检测猪瘟病毒(CSFV)及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据Gen Bank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性(翠绿色),其他非CSFV样本的检测结果均为阴性(桔红色),且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。

摘要：33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒(fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。

摘要：利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种特异、灵敏和快速的H11亚型禽流感病毒(AIV)RT-LAMP可视化检测方法。根据H11亚型AIV HA基因保守序列,设计6条特异性引物,优化反应条件,进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,该方法只能扩增H11亚型AIV,不与其他亚型AIV和禽病病原体发生交叉反应,表明该方法特异性强;对H11亚型AIV RNA的检测下限为10fg,表明该方法敏感性高;在63℃等温条件下作用1h即可完成全部扩增反应;对206份临床样品的检测结果与病毒分离一致。结果表明,本研究中建立的H11-RT-LAMP检测方法具有简便、快速和结果可视化的优点,尤其适合在基层兽医站和养殖场进行快速检测,具有非常广阔的应用前景。

摘要：为了建立一种能快速检测衣阿华支原体(MI)的方法,根据基因库中MI种蛋白基因(species pro-tein 1)的保守序列,设计了1套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了用以可视化检测衣阿华支原体的LAMP方法。结果显示,用此LAMP方法对衣阿华支原体的检测结果为阳性(肉眼观察可见翠绿色),而对其他常见病原体的检测结果均为阴性(肉眼观察可见桔红色),敏感性可达10fg DNA,高于常规PCR 100倍;该方法可在1h内完成,可通过肉眼观察颜色直接判定结果。结果表明,建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于禽MI感染的快速检测。