摘要：试验旨在优化蟾酥注射液的提取工艺,试验以吲哚类总生物碱(以5-羟色胺盐酸盐计)的含量为考察指标,以加水倍数(A)、加热温度(B)和提取时间(C)为考察因素,通过L_(9)(3^(4))正交试验优化蟾酥注射液的提取工艺,确定提取工艺参数,并采用最大极差法对正交试验数据分析处理。结果显示,加水倍数是影响蟾酥注射液主要成分含量的主要因素,蟾酥注射液的最佳提取工艺为10倍加水量浸泡,加热煮沸(100℃),提取时间4 h。验证性试验按最优工艺制备3批样品,采用紫外可见分光光度(UV)法测定蟾酥注射液中吲哚类总生物碱的含量为9.92 mg/L。研究表明,该提取工艺稳定可靠,可用于中试生产。

摘要：为建立一种能够区分鸽新城疫病毒(NDV)野毒株与常用新城疫疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法(RAA),本研究针对基因Ⅵ型鸽源NDV和La Sota的NP基因设计出1对特异性引物,经过优化引物浓度、反应时间、反应温度,建立了能够区分鸽NDV野毒株与La Sota的RAA检测技术。对其特异性、敏感性和重复性进行测试,并应用建立的方法检测了45份临床样品。结果显示:该技术在15℃~39℃的恒温条件下,可于15 min内完成对目标基因的扩增;对禽支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和衣原体等常见病原的检测结果均为阴性;重组质粒标准品检测下限为39.5 copies/反应;45份临床病死鸽样品的检测,检出28份阳性,与常规PCR方法的检测结果一致。本研究结果说明建立的RAA方法可应用于临床样品的快速检测。

摘要：为了建立梨形虫(Piroplasmida)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)的双重PCR检测方法,试验根据梨形虫的18S rRNA基因和伊氏锥虫的kDNA基因设计两对特异性引物,以吕氏泰勒虫和伊氏锥虫阳性样品DNA为模板进行单重PCR和双重PCR,并对双重PCR的退火温度进行优化,对本研究建立并优化的双重PCR方法进行特异性试验、敏感性试验及临床样品的检测。结果表明:本研究建立的双重PCR方法能够扩增出350 bp和600 bp的特异性目的条带,而无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体样品均呈阴性,梨形虫和伊氏锥虫最低检测浓度分别为54.70 fg/μL和14.30 fg/μL,用本试验建立的方法对临床样品的检测结果与对照方法(巢式PCR)检测结果一致。说明本研究成功建立了灵敏、快速、简便、特异性高的双重PCR检测方法,能够用于梨形虫和伊氏锥虫的临床检测及流行病学调查。

摘要：为制备猪肠病毒G型(EV-G)非结构蛋白3C的多克隆抗体,本研究参考EV-G分离株CH/17GXQZ/2017的序列设计带有酶切位点的引物扩增3C全基因,通过RT-PCR扩增,将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-EVG-3C。将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞中,通过对诱导条件(诱导温度、IPTG浓度以及诱导时间)的筛选,获得重组3C蛋白的最优表达条件。将表达纯化后的3C蛋白通过皮下注射的方式免疫新西兰大白兔,制备3C蛋白多克隆抗体,通过间接ELISA测定效价,并利用间接免疫荧光试验及Western-blot进行验证。结果显示,表达的3C蛋白主要以包涵体的形式存在,相对分子质量约为38.8 ku;经间接ELISA方法测定,制备的EV-G兔抗效价达到1∶8192000;间接免疫荧光试验和Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能与EV-G特异性结合,具有良好的免疫原性和反应性。本研究为EV-G的诊断以及3C蛋白的功能研究提供了参考。