摘要：实验动物学对于医学院校研究生是一门重要的实用课程,建立线上课程可以针对研究生的学习需求,拓展教学内容,提升学习效率,提高学习效果。本文对线上实验动物学课程的主要特点、内容设置、设计要点等进行了梳理分析。线上课程应比线下课程涵盖更多的内容,融入更丰富的学习方式,方便学生自主选择性的学习。线上课程设置与线下课程有机结合,对于研究生的专业知识和专业技能提升很有帮助。

摘要：目的:确定提高VASN基因敲除小鼠基因型检出率的方法。方法:根据VASN基因外显子设计2对gRNA,将Cas9和gRNA共注射入受精卵生产出F0代小鼠,将F0代小鼠进行近交繁殖产生F1代,分别用3种方法鉴定F1代小鼠基因型,比较3种方法的检出率。方法一:DNA提取试剂盒A+DNA高保真聚合酶a+PCR扩增条件1,鉴定16只小鼠;方法二:DNA提取试剂盒A+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件2,鉴定14只小鼠;方法三:DNA提取试剂盒B+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件3,鉴定9只小鼠。结果:Cas9和gRNA共注射入319枚受精卵,分5批移植,其中3批受孕成功,胚胎移植率为60.00%,共获得16只F0代小鼠,经过自交繁殖共获得39只F1代小鼠。分3批分别采用3种方法进行鉴定,方法一的基因型检出率为12.50%;方法二的基因型检出率为64.29%;方法三的基因型检出率为100.00%,且与测序结果吻合,电泳图无杂带。结论:DNA提取试剂盒B+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件3的基因型鉴定检出率最高。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9系统在树鼩骨骼肌卫星细胞中敲除p53基因并检测其增殖活性。方法:通过生物信息学方法对树鼩和15种哺乳动物的p53蛋白氨基酸序列进行同源性分析,根据树鼩基因组信息设计可编辑树鼩p53突变位点sgRNA,构建lenti CRISPR v2-sgp53基因编辑重组质粒,用293T细胞进行慢病毒包装,感染树鼩骨骼肌卫星细胞,嘌呤霉素筛选多克隆细胞并扩增;通过测序确定基因编辑效果。采用CCK8法检测细胞增殖活性,采用western blotting验证p53蛋白表达水平。结果:与人p53和小鼠p53氨基酸序列同源性(96.92%)相比,人p53和树鼩p53的氨基酸序列同源性(98.21%)更高。进化树分析显示,与小鼠相比,人与树鼩的亲缘关系更近。成功构建了3个靶向树鼩p53编辑的重组载体:lenti CRISPR v2-sgp53-g1、lenti CRISPR v2-sgp53-g2、lenti CRISPR v2-sgp53-g3,均成功在树鼩骨骼肌卫星细胞上实现p53基因编辑产生突变,导致p53功能丧失,p53的突变提高了树鼩骨骼肌卫星细胞的增殖能力。经药筛后的树鼩骨骼肌卫星细胞p53基因敲除成功,p53蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:本研究利用CRISPR/Cas9系统成功使树鼩骨骼肌卫星细胞p53基因突变、功能丧失,为后续树鼩p53基因敲除模型的建立提供了重要的分子生物学基础。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果:成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;pALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建了VASN基因敲除的AML12细胞,为后续体外研究VASN在肝细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。

摘要：目的:探讨长链非编码RNA RP1-171K16.5(lnc171)对肝癌细胞的作用和机制。方法:采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测正常人和肝癌患者血浆外泌体、正常肝细胞和肝癌细胞中lnc171的表达水平;设计siRNA转染肝细胞,分为空白对照组(Blank组)、阴性对照组(siNC组)和干扰组(si171组);采用Transwell实验检测lnc171对细胞迁移的影响;RegRNA、miRDB和LncBase在线靶基因预测网站预测lnc171的靶基因,并采用Venny 2.1对3个数据库预测结果取交集;双荧光素酶报告基因实验验证lnc171和miR-149-5p之间的靶向关系;生物信息学分析miR-149-5p的靶蛋白RAP1并用qPCR验证。结果:肝癌患者血浆外泌体中lnc171的表达水平高于正常对照者(P<0.01),肝癌细胞中lnc171的表达水平高于正常肝细胞(P<0.05);与siNC组比较,转染si171-3后,HL-7702和Hep3B细胞迁移数量明显下降(P<0.05);生物信息学预测lnc171的靶基因为miR-149-5p;与siNC组比较,Hep3B细胞转染si171-3后miR-149-5p的表达量升高(P<0.001);lnc171WT中miR-149-5p mimics组荧光素酶活性较miR-NC组下降(P<0.05);利用TargetScan和MicroT-CDS在线网站预测miR-149-5p的靶基因取得256个交集靶基因,将其放入DAVID数据库中进行KEGG通路富集得到与迁移相关的RAP1信号通路。生存分析发现,Ras-associated protein 1A(RAP1A)高表达的肝癌患者预后差。结论:lnc171在肝癌中高表达,可能通过靶向作用miR-149-5p调控RAP1A表达水平从而促进肝癌细胞迁移。