摘要：目的对血清癌胚抗原(CA)125测定在卵巢癌诊断中的价值进行评价。方法参照诊断性试验的评价指标,对文献的设计方案、研究对象的选择、参考值的确立、诊断试验的评价指标等进行评价。结果纳入的63篇文献中有62篇与金标准进行了比较,但未提及是否采用盲法;所提供的诊断性指标(敏感度、特异度、似然比等)不全面,对偏倚的控制没有描述,对采用同一种方法测定的研究文献,其所得结论不完全相同。结论提示目前尚无临床证据表明CA125可作为诊断卵巢癌的独立指标。

摘要：目的利用微卫星DNA技术进行体细胞核移植囊胚的鉴定。方法根据Mouse Genome Database设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物,提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB/c小鼠、受体C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA,使用巢式聚合酶链反应扩增4个微卫星位点DNA片段,即D3Mit28、D11Mit258、D12Mit136及D14Mit50。对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果巢式聚合酶链反应可扩增微量基因组DNA,通过微卫星DNA序列的扩增,证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同,而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。结论体细胞核移植囊胚基因组来源于供体BALB/c小鼠。

摘要：背景:造血干细胞来源目前包括骨髓干细胞、外周血干细胞和脐带血干细胞,寻找新的干细胞来源以满足临床移植需要一直是人们的希望。从妊娠第5周起,肝脏中发育成完善的血窦系统,此后造血干细胞就可以随血液流动迁移。目的:观察人胎儿血造血干/祖细胞的生物学特性并对其进行非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠移植。设计:对照实验。单位:广西医科大学第一附属医院血液科。对象:①细胞来源:21例胎儿血标本取自胎龄为18～29周[(24.2±3.2)周]死亡胎儿及21例足月脐带血标本取自广西医科大学第一附属医院产科2002-10/2003-02。所取的血标本均取得其家属的知情同意。②实验动物:非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠12只,6～7周龄,雌性,无菌饲养于超净工作台中。方法:采用流式细胞术,检测胎儿血的造血干/祖细胞表面标志,包括CD34,CD38,HLA-DR及CD90,同时与21例足月儿脐血作比较。并将人胎血单个核细胞移植给6只经亚致死量照射的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠,5周后观察其植入情况,采用流式细胞术检测小鼠骨髓中人白细胞的含量,以及采用聚合酶链反应检测小鼠骨髓中的人Cart-1基因。主要观察指标:①胎血和脐血造血干/祖细胞表面标志的表达情况。②将胎血细胞移植给非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠的植入情况。结果:①人胎血中CD34+细胞的百分率显著高于足月脐血[(2.2588±0.7209)%,(1.5729±0.4783)%,P=0.0004],CD34+CD38-细胞和CD34+CD90+细胞的百分率也均显著高于足月脐血[(1.2986±0.4706)%,(0.8710±0.4095)%,P=0.0016;(0.9300±0.4692)%,(0.5600±0.3658)%,P=0.0324]。②6例胎血中的4例可顺利重建经亚致死量照射的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠的造血,移植后5周在小鼠骨髓中仍可检测到人的白细胞和人Cart-1基因。结论:人胎儿血中有比足月脐血更高含量的造血干/祖细胞,其单个核细胞能植入非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠骨髓,并重建髓、淋巴系全面造血。胎儿血有望成为多能造血干细胞来源。

摘要：背景:体细胞核移植技术已成功用于多种动物的克隆,但其过程中核移植技术的成功率较低。目的:通过对卵母细胞不同去核方法的对比分析,观察其对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响,并利用微卫星DNA技术进行核移植囊胚鉴定,初步建立小鼠体细胞核移植技术平台。设计、时间及地点:以卵母细胞为观察对象的对比实验,于2005-09/2007-10在广西医科大学医学科学实验中心及动物实验中心完成。材料:选用C57BL/6小鼠卵母细胞为受体、BALB/c小鼠卵丘细胞为供体。取600枚受体卵母细胞,根据去核方法不同分为3组,每组200枚。方法:①盲吸法:吸出卵母细胞第1极体及其附近的适量胞质。②蔗糖辅助去核法:以含蔗糖显微操作液预处理卵母细胞,吸出可见的细胞核等遗传物质。③荧光染色去核法:Hoechest33342预处理卵母细胞,在紫外光下用去除遗传物质。乙醇联合二甲氨基嘌呤进行重构胚激活,激活后卵裂培养基液滴中培养。根据MouseGenomeDatabase设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物,提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB/c小鼠、受体C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA,使用巢式聚合酶链反应扩增选定的序列。最终扩增出4个微卫星位点DNA片段,即D3Mit28,D11Mit258,D12Mit136及D14Mit50。主要观察指标:比较3种去核方法的去核率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数差异。对巢式聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果:①盲吸去核法的去核率、处理重构胚的体外发育能力均低于荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法(P0.05)。③巢式聚合酶链反应可扩增微量基因组DNA,通过微卫星DNA序列的扩增,证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同,而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。结论:荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法适用于小鼠核移植,可支持小鼠体细胞核移植胚胎的早期发育。微卫星分析证实体细胞核移植囊胚为供体BALB/c小鼠的克隆,微卫星DNA分析可用于小鼠体细胞核移植囊胚的鉴定。

摘要：背景肿瘤患者体内的抗肿瘤免疫受到抑制。增强细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)的活性是提高过继免疫治疗效果,促进肿瘤康复的有效途径之一。目的对转导肿瘤坏死因子(TNF-α)基因的CTL的生物学特性及抗肿瘤活性进行研究,探讨细胞因子基因疗法和过继免疫治疗肿瘤的新途径。设计随机区组实验研究。地点和对象实验在广西医科大学医学实验中心完成。从人肝细胞癌组织中分离淋巴细胞,用BEL7404和IFN-г诱导得到CTL。BALB/c裸小鼠28只,雄性,4～6周龄,体质量18～20g,购自北京医科大学实验动物科学部(SPF级,合格证书医动字第01-3048号)干预用重组反转录病毒载体介导对CTL进行TNF-α基因转导。于每只裸鼠右前肢腋窝皮下注射注射BEL7404,建立荷瘤裸鼠模型,28只裸鼠按体质量分为4组,每组7只。观察转基因CTL对肿瘤原位(右前肢腋窝)及异位(左前肢腋窝皮下)注射治疗效果,分别用生理盐水注射治疗作对照。主要观察指标①检测TNF-α基因转导前后CTL的生长形态,增殖能力,TNF-α分泌量、细胞表型。②体外不同作用时间和效靶比浓度对BEL7404的杀伤效应。③各实验组的肿瘤生成时间,生长速度及肿瘤生成率。结果转基因CTL的生长形态、增殖活性及细胞表型与CTL相似,但具有持续、高效表达TNF-α的能力。

摘要：目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.

摘要：目的建立一种最优化的提取高质量人类精液基因组DNA的方法,为辅助生殖技术男性不育分子生物学科学研究提供技术支持。方法提取人类精液基因组DNA,优化设计实验步骤,研究初始样品类型、初始样品量、二硫苏糖醇(DTT)剂量、蛋白酶K(PK)消化时间、混匀震荡等因素对DNA的提取效果的影响,应用核酸定量和琼脂糖凝胶电泳分析比较各组提取效果的差异。结果应用自然分层后的精液沉淀提取DNA较原始精清可获得较高浓度的DNA。初始样品量为100～150μl时可获得较好的提取效果,随着样本量的增加,DNA提取效果逐渐下降。在样本中加入DTT可以明显提高DNA产量,DTT的加入利于DNA裂解及提取,且增加了DNA的稳定性。PK适宜消化时间为5～8 h;时间过短(12 h)则会造成DNA降解。在PK消化时,摇床震荡可以提高DNA产量。结论应用自然分层后的精液沉淀提取DNA,当初始样品量为100～150μl时,在样本中加入1M DTT 20μl,PK消化时间为5～8 h,并在消化时摇床震荡,可以获得高质量的基因组DNA。

摘要：血液分析仪是目前临床血液一般检查最常用的检测仪器，以往使用手工操作显微镜计数方法，由于操作过程的随机误差，实验器材的系统错误和检测方法的固有误差，使显微镜法细胞计数的实验结果准确性受到很大影响。20世纪40年代期，美国人库尔特先生发明并申请了粒子计数技术的设计专利；50世纪初期，电子血细胞计数仪开始应用于临床，开创了血细胞分析仪的新纪元。随着基础医学的发展，高新科技的应用，特别是计算机技术的引用，血细胞分析仪的分析技术及临床应用都取得了令人瞩目的进展。现在的血细胞分析仪一般能为临床疾病诊断、鉴别诊断、治疗和疗效观察提供十几项至几十项检测参数。进入21世纪以来，我国的各级医院已基本普及了血细胞分析仪，使血细胞分析的质量有了明显的提高，同时．过于机械的工作方式降低了对专业知识的要求，出现了诸如过分相信仪器结果等一些问题。现结合我国血细胞分析仪使用现状，概述在仪器使用中应注意的几个问题。

摘要：背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定。方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN。用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析。结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750bp。构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750bp处有特异性条带。插入方向经PCR鉴定,350bp处有特异性条带。限制性内切酶法鉴定,750与6000bp处有特异性条带。DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%。结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向。

摘要：目的:克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白(PBAP)β亚基基因,并对该基因进行序列分析。方法:从短尾蝮蛇的毒腺中提取总RNA,设计引物并采用RT-PCR技术进行体外扩增PBAPβ亚基cDNA序列,将PCR扩增产物克隆至载体PMD-19T,通过PCR进行鉴定后,提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果:序列分析结果显示:PBAPβ亚基cDNA序列长度为441bp,编码框由146个氨基酸组成,其中包括由23个氨基酸的信号肽,以及123个氨基酸组成的成熟肽。结论:PBAPβ亚基基因及其氨基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素β亚基的基因以及氨基酸序列相比较,有88%～99%的同源性。