摘要：目的:建立检测MAPK激酶信号转导通路ERK1、JNK1、p38各基因mRNA表达情况的多重逆转录聚合酶链式反应(Multi RT-PCR)的方法。方法:自Genebank中获取大鼠及人源ERK1、JNK1及p38的基因序列,将大鼠与人的基因序列用Align X进行同源性比较,选取保守区应用primer 5软件设计3对引物,建立Multi RT-PCR检测体系,分别扩增ERK1、JNK1、p38基因,产物长度分别403、3096、07 bp;对RT-PCR扩增产物分别切胶回收进行PCR产物测序进一步验证。结果:①应用Multi RT-PCR方法对11例大鼠及11例人肝细胞癌组织进行检测,琼脂糖电泳结果显示各基因产物条带清晰、无引物二聚体产生、无非特异性扩增产物,并对各基因产物片段分别切胶测序得到证实;②对22例肝癌组织检测结果表明在肝癌组织中ERK1、JNK1、p38mRNA阳性率分别为95.83%、100%、100%,且在表达丰度上有明显的变化。结论:所建立的MAPKMulti RT-PCR检测方法具有特异性强、效率高、简单易行、可靠的特点,对MAPK信号转导通路在疾病中的作用研究具有较强的应用价值。

摘要：背景：心肌肥大是以心肌细胞体积增加和蛋白质含量增多为主要特征的生长异常，防治心肌肥大的药物中，一些化学合成钙拮抗剂疗效较好，而中药二七的活性成分中也具有钙离子拮抗作用 目的：观察三七总皂甙对腹主动脉缩窄大鼠心肌肥大的影响。 设计：完全随机分组设计，对照实验。 单位：广西医科大学药理学教研室。 材料：实验于2001-11／2003-02在广西医科大学实验中心药理实验室完成。选用25只健康雄性清洁级SD大鼠。将大鼠随机分为5组：假手术对照组，腹主动脉缩窄组，三七总皂甙低、中、高剂量组，每组5只方法：腹主动脉缩窄组，三七总皂甙低、中、高剂量组均做腹主动脉缩窄手术(麻醉大鼠，在左肾动脉与腹主动脉汇合处上分离一小段腹主动脉，穿过一条丝线，将直径0．6mm针头平行于腹主动脉一并结扎，抽出针头，造成腹主动脉的缩窄)以建立压力超负荷性心肌肥大模型。假手术组除不作缩窄外，其余操作相同。假手术对照组和腹主动脉缩窄组在手术当天及术后每日腹腔注射生理盐水1mL／kg，三七总皂甙低、中、高剂量组在手术当天及术后每日腹腔注射1mL／kg三七总皂甙的生理盐水溶液，剂量分别为50，100和150mg／(kg·d)，持续3周 给大鼠做腹主动脉缩窄术3周后，称其体质量，左心质量，计算全心质量／体质量、左心室质量／体质量即左室质量指数。用光学显微镜和DMR+Q550病理图像分析仪观察切片，每张切片随机选取5个视野，测30个心肌细胞的直径，取平均值。组间差异比较采用单因素方差分析和q检验。 主要观察指标：行腹主动脉缩窄术3周后，各组大鼠全心质量、左心室质量、全心质量／体质量、左心室质量指数，心肌细胞直径比较。 结果：大鼠25只均进入结果分析。①光学显微镜下观察三七总皂甙对大鼠心肌细胞直径的影响：与假手术对照组相比，腹主动脉缩窄组大鼠的心肌细胞发生肥大变化，心肌细胞直径变大；三七总皂甙低剂量组细胞与腹主动脉缩窄组相似；三七总皂甙中剂量组的细胞肥大在定程度上逆转，但仍比假手术对照组细胞直径大、染色略深；三七总皂甙高剂量组细胞大小、颜色均接近假手术对照组，胞浆染色较三七总皂甙中剂量组更浅，细胞无明显肥大反应。②全心质量／体质量、左室质量指数：腹主动脉缩窄组明显大于假手术对照组和三七总皂甙高剂量组(P＜0．01)。全心质量／体质量、左室质量指数：三七总皂甙低、中剂量组与腹主动脉缩窄组接近(P＞0．05)。③心肌细胞直径：三七总皂甙中剂量和高剂量组明显小于腹主动脉缩窄组(P＜0．05，0．01)。 结论：剂量为100～150mg／(kg·d)的三七总皂甙能抑制腹主动脉缩窄大鼠心肌肥大的形成，且剂量越大，抑制作用越明显。

摘要：背景:有研究显示,三七总皂甙能明显增强大鼠的学习与记忆能力,但其对外周神经系统的作用仍需进一步观察。目的:观察三七总皂甙对大鼠星状神经节快兴奋性突触后电位的作用。设计:观察对照实验。单位:广西医科大学药理学教研室。材料:实验于2005-01/2006-02在广西医科大学实验中心药理实验室完成。选用30只健康雄性清洁级SD大鼠,体质量(220±20)g,由广西医科大学实验动物中心提供。SEN-7203数字式三通道刺激器、MEZ8301型微电极放大器为日本NIHONKOHDEN公司产品,玻璃微电极拉制仪、微电极操纵仪均为日本Narishige公司产品。三七总皂甙(为云南昆明雅阁臣药业公司产品批号020802)氯化乙酰胆碱(Ach)为美国Sigma公司产品。方法:大鼠麻醉后迅速处死,打开胸壁,在显微镜下将星状神经节离体并将标本迅速移至灌流浴槽,剥去神经节外层结缔组织膜,用金属细针固定其边缘。用含体积分数0.95O2与体积分数0.05CO2混合气体和pH为(7.4±0.05)的Kreb's持续、恒温(34.0±0.5℃)灌流神经节,同时采用质量浓度范围0.08～0.16g/L三七总皂甙对神经节进行灌流和培养。①用内充3mmol/LKCl的玻璃微电极穿刺离体星状神经节神经元,记录细胞内突触后膜除极反应的幅度。②选用三七总皂甙可逆性抑制快兴奋性突触后电位的最高浓度0.16g/L直接灌流,观察三七总皂甙对外源性Ach(1mmol/L,1min)引起的突触后膜除极反应幅度和时程的影响。③选用三七总皂甙可逆性抑制快兴奋性突触后电位的最高浓度0.16g/L直接灌流,观察三七总皂甙对膜性质(膜电阻和膜电位)的影响。主要观察指标:①细胞内突触后膜除极反应的幅度。②最高浓度0.16g/L三七总皂甙对外源性Ach引起的突触后膜除极反应幅度和时程及对膜性质(膜电阻和膜电位)的影响。结果:纳入大鼠30只均进入结果分析。①三七总皂甙对快兴奋性突触后电位的影响:三七总皂甙在0.10～0.16g/L范围内可逆性抑制快兴奋性突触后电位,使快兴奋性突触后电位幅度减小,或使顺行动作电位变成快兴奋性突触后电位,三七总皂甙质量浓度越高,对快兴奋性突触后电位的抑制作用越明显。抑制作用多在三七总皂甙灌流3～10min内出现,0.16g/L三七总皂甙起效最快,通常在3～4min内就使快兴奋性突触后电位明显下降。停止三七总皂甙灌流后,用正常Kreb's冲洗15～20min可使快兴奋性突触后电位基本恢复至给药前的对照水平。②三七总皂甙对外源性Ach引起膜除极反应的影响:用0.16g/L三七总皂甙灌流前后Ach除极反应的幅度和时程分别为(15.5±2.4)mV,(256.1±21.5)s,与给三七总皂甙后无明显差异[(14.3±1.9)mV,(228.6±24.5)s,P>0.05]。③三七总皂甙对膜性质的影响:给药前后平均膜电位差异不明显[-(55.5±12.1),-(54.3±10.4)mV,P>0.05]。平均膜电阻亦无明显差异[(53.9±5.1),(55.1±4.8)MΩ,P>0.05]。结论:三七总皂甙对大鼠星状神经节快兴奋性突触后电位有可逆性抑制作用,抑制可能是通过突触前机制产生。

摘要：背景:研究表明,自由基增多致脂质过氧化是缺血再灌注损伤的主要因素。性味苦辛平,有行气止痛、活血化瘀、祛风通络功用的芸香科植物两面针提取物有抗氧化作用。目的:观察氯化两面针碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用,并分析其作用途径。设计:随机对照实验。单位:广西医科大学药理学教研室和化学教研室。材料:选用健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,体质量250～300g。氯化两面针碱(广西医科大学化学教研室提供,批号:20050609)。MS4000U生物信号定量记录分析系统(广州市龙飞达科技有限公司)。日立7170A型全自动生化分析仪。722N可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。盐酸维拉帕米(上海禾丰制药有限公司,批号:020701,2mL/支)。丙二醛、超氧化物歧化酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)。方法:实验于2004-06/2006-05在广西医科大学药理学教研室和化学教研室完成。①将心电图正常大鼠60只分性别按随机数字表法分为6组:假手术组,模型组,氯化两面针碱2,1,0.5mg/kg3个剂量组,阳性对照组,每组10只,雌雄各半。假手术组:穿线不结扎,90min后结束实验;其余50只大鼠:结扎冠状动脉左前降支缺血30min,再灌注60min。阳性对照组、不同剂量氯化两面针碱组、模型组:在结扎冠状动脉左前降支前10min经股静脉分别注射维拉帕米2mg/kg,氯化两面针碱2,1,0.5mg/kg,5mL/kg,等体积生理盐水。②再灌注的同时用标准肢体Ⅱ导联心电图连续监测,记录60min内各组心律失常类型、发生率及持续时间;并记录再灌注15min及60minST段的变化。③实验完毕,采用全自动生化分析仪检测血清心肌酶学指标。分别用硫代巴比妥酸法与黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织丙二醛含量及超氧化物歧化酶活力。④两组间计量和计数资料差异比较采用t检验和χ2检验。主要观察指标:各组大鼠心律失常发生情况、心电图ST段抬高程度、血清心肌酶学指标变化和心肌组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶活力比较。结果:大鼠60只均进入结果分析。①大鼠心律失常及心电图ST段抬高程度变化:1和2mg/kg氯化两面针碱组大鼠心律失常出现的时间明显迟于模型组(P<0.05,0.01)。1和2mg/kg氯化两面针碱组和阳性对照组大鼠心律失常持续时间明显短于模型组(P<0.05～0.01),各类型心律失常发生率明显少于模型组(P<0.01),再灌注15和60min时ST段抬高程度均明显低于模型组(P<0.05～0.01)。②血清心肌酶水平:模型组心肌缺血再灌注60min后明显高于假手术组(P<0.01),1和2mg/kg氯化两面针碱组明显低于模型组(P<0.01,P<0.05),且随氯化两面针碱剂量增加,下降幅度增加。阳性对照组明显低于模型组(P<0.05～0.01)。③心肌组织超氧化物歧化酶活力:模型组心肌缺血再灌注60min后明显低于假手术组(P<0.01);1和2mg/kg氯化两面针碱组明显高于模型组(P<0.01),且随氯化两面针碱增加,上升幅度增加。④心肌组织丙二醛含量:模型组心肌缺血再灌注60min后明显高于假手术组(P<0.01)。1和2mg/kg氯化两面针碱组明显低于模型组(P<0.01),且随氯化两面针碱增加,下降幅度增加;阳性对照组明显低于模型组(P<0.05)。结论:①1和2mg/kg氯化两面针碱能降低心肌缺血再灌注大鼠心律失常的发生率,推迟心律失常的发生时间并缩短其持续时间,降低再灌注15和60min时ST段抬高程度;该作用效果与维拉帕米相当。②1和2mg/kg氯化两面针碱能减少心肌缺血再灌注大鼠心肌酶的释放,减轻氧自由基损伤程度,起到保护大鼠缺血再灌注心肌细胞损伤的作用,且该作用呈一定的剂量依赖性。

摘要：目的　研究龙眼参中黄酮类成分的最佳提取条件。方法　采用正交试验法 ,以温度、乙醇浓度、提取时间及提取次数为因素 ,每个因素选取 4个水平。结果　提取温度对黄酮类成分的含量影响最为显著 ,其余因素次之。结论　最佳工艺为 :A4 B2 C4 D3,即以 90 %乙醇为溶剂 85°C提取 2次 ,每次 2h。

摘要：目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.

摘要：背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定。方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN。用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析。结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750bp。构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750bp处有特异性条带。插入方向经PCR鉴定,350bp处有特异性条带。限制性内切酶法鉴定,750与6000bp处有特异性条带。DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%。结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向。