摘要：为了建立一种能够同时鉴别H5、H7、H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎6种鸡病毒性呼吸道传染病病原体的GeXP检测方法,本研究根据这些病原体各自的基因保守序列,设计合成了7对特异性引物,优化反应条件,用单一病毒、混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性和准确性,以不同拷贝数的克隆质粒来检测GeXP方法的灵敏度。检测34份临床阳性样品,进一步验证该法的可靠性。结果显示,在7对引物同时存在的GeXP反应体系中,可特异性地扩增出相关6种病毒目的片段,并可在102拷贝/μL水平同时特异地检测出鸡6种病毒性呼吸道传染病,GeXP方法检测34份临床阳性样品结果与病毒分离一致。本研究建立的GeXP方法不仅可高通量检测6种病原体,而且具有特异性强和灵敏度高的特点,适用于临床样品混合感染的快速鉴别诊断,对这6种发病特征及临床症状相似的鸡病毒性呼吸道病的有效防控有很高的实际应用价值。

摘要：研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的囊膜糖蛋白E2基因在烟草中表达及其表达产物的反应原性。根据GenBank中BVDV的基因序列设计特异引物,构建含有E2基因的植物表达载体pBI121-E2,农杆菌介导的叶盘法转化烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。结果显示:通过PCR扩增和real-time PCR方法检测获得5株低拷贝的转E2基因的烟草。Western blot检测显示烟草中表达的E2蛋白可以被牛病毒性腹泻病毒的阳性血清识别,具有反应原性。本研究为利用植物作为生物反应器生产E2口服疫苗的研发与应用奠定了基础。

摘要：应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种H7亚型和N9亚型禽流感病毒(AIV)可视化快速检测方法。根据GenBank中H7亚型和N9亚型AIV HA和NA基因序列,在其保守区域设计筛选出H7亚型和N9亚型AIV的特异性LAMP引物各一套,优化反应条件,建立能检测H7亚型和N9亚型AIV RT-LAMP方法,并进行特异性和敏感性检验。结果显示,该法用实时浊度仪63℃反应1h,能特异性地检测H7亚型和N9亚型AIV,而对其他15个H亚型和8个N亚型的AIV和禽类呼吸道病原体均无扩增,最低能检出10拷贝·μL-1目的基因。所建立的H7亚型和N9亚型RT-LAMP方法特异性强、敏感性高,结果可视化,操作简便、快速,为H7、N9和H7N9亚型AIV的有效防控提供技术支撑,具有较好的应用前景。

摘要：根据已发表的禽脑脊髓炎病毒的VP2基因序列,设计并合成了6对特异扩增禽脑脊髓炎病毒VP2基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,对采集的禽临床样品的核酸分别进行了检测。结果表明,该法只检出禽脑脊髓炎病毒。敏感性扩增结果表明,Lamp检测禽脑脊髓炎病毒为100fg的RNA模板。该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对禽脑脊髓炎病毒的快速检测。

摘要：根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a(+)为载体构建重组表达载体CFP-10/pET32a(+)。重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.9mmol/L IPTG37℃诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS-PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni-NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95%,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。

摘要：根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法。该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL。本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑。

摘要：目的为寻求一种牛源隐孢子虫的快速检测手段。方法根据牛隐孢子虫COWP基因和ITS-1基因,设计合成两对特异性引物,用以特异性扩增牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫,扩增长度分别为1 033bp和263bp。通过反应条件的优化,特异性试验及扩增片段的序列测定的验证,建立多重PCR方法。结果应用该方法对采集自广西不同地区的1613份牛粪样进行牛隐孢子虫检测,安氏隐孢子虫阳性粪样为189份,微小隐孢子虫阳性粪样1份,与常规隐孢子虫分离鉴定结果一致。结论表明该方法可用于隐孢子虫的流行病学调查及临床诊断。

摘要：为了建立检测贝类单孢子虫的二温式PCR方法,试验根据GenBank中单孢子虫的基因保守序列设计了1对特异性引物,并对二温式PCR扩增条件进行优化。结果表明:用二温式PCR方法对单孢子虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的333 bp特异性扩增带,而对折光马尔太虫、派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体进行扩增,结果全为阴性;该方法最低能检测到1 fg的单孢子虫质粒DNA。

摘要：为建立可同时鉴别检测鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的基因序列,分别设计3对特异性引物,通过三重RT-PCR扩增条件优化、敏感性和特异性试验,建立了鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT-PCR方法。使用该方法对同一样品中的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均得到与试验设计相符的202bp(鸭Ⅰ型肝炎病毒),351bp(鸭圆环病毒)和474bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对小鸭温病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测到1pg的鸭Ⅰ型肝炎病毒RNA、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA。建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒感染的检测。

摘要：根据C亚型禽肺炎病毒F基因序列,设计了一对针对C亚型禽肺炎病毒的特异性引物,应用该引物建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测C亚型禽肺炎病毒的方法,并对建立的方法进行特异性、敏感性测定和临床样品检验。经检验该方法能特异性地鉴别检测禽肺炎病毒,特异性好;敏感性可检测到10个拷贝的禽肺炎病毒质粒DNA模板;对收集的54份鸡肺病料样品进行检测,没有检测到C亚型禽肺炎病毒阳性病料。建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法检测C亚型禽肺炎病毒具有特异、敏感、快速、定量等优点,用该方法检测证实,采集的临床样品中还没有C亚型禽肺炎病毒的存在。