摘要：【目的】本研究旨在对广西地区母猪子宫内膜炎主要致病菌进行分离鉴定并建立一种病原菌多重PCR检测方法。根据病原菌分离鉴定结果,选取主要革兰氏阳性致病菌葡萄球菌(Sau)、链球菌(SS)、粪肠球菌(Efa)和革兰氏阴性致病菌大肠杆菌(Eco)、沙门氏菌(Sal)、肺炎克雷伯菌(Kpn)、奇异变形杆菌(Pmi)进行多重PCR检测方法的建立。【方法】提取3种革兰氏阳性菌株基因组并基于tuc、gdh、efs的保守区域设计3对特异性引物;提取4种革兰氏阴性菌株基因组并基于uid-A、SAL、ITS、ureR的保守区域设计4对特异性引物,进行引物特异性多重PCR验证同时对扩增条件中的退火温度、引物浓度优化,建立检测7种病原菌的多重PCR,完成样品检测评估。【结果】广西地区该猪场子宫内膜炎主要革兰氏阳性致病菌为葡萄球菌、链球菌、粪肠球菌,革兰氏阴性致病菌为大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌。建立多重PCR检测方法,退火温度在50℃时最佳。【结论】广西地区该猪场母猪子宫内膜炎的主要病原菌在本研究中成功地分离鉴定并建立多重PCR检测方法,为广西地区母猪子宫内膜炎的快速诊断和防控提供技术支持。

摘要：为探究MyD88在狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染中的作用,本实验针对MyD88的mRNA靶序列设计并合成3对不同的siRNA序列,利用脂质体瞬时转染BV2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western blot检测siRNA对BV2细胞中MyD88的干扰效率。结果显示,转染24 h后,各实验组中MyD88 mRNA表达量均显著低于阴性对照组,其中siRNA-M174的效果最佳、siRNA-M587次之;将200 nM siRNA-M174、siRNA-M587转染BV2细胞24 h后,经计算,干扰效率分别为75.35%和71%,两者共转染后,干扰效率为86.5%。结果表明,本实验成功筛选出靶向MyD88基因的有效干扰序列。脂质体瞬时转染筛选出的2对siRNA于BV2细胞,RABV接种BV2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western blot检测。接毒后转染24 h,实验组MyD88基因的mRNA表达量低于阴性对照组,MyD88蛋白及RABV的N蛋白表达量下降。本实验结果证实了MyD88基因被特异性siRNA干扰后,也影响RABV的蛋白合成,为后续MyD88与狂犬病病毒的互作研究提供实验依据。

摘要：试验以昆明小鼠为研究对象,对三联吡啶锌配合物(LB-ZnI_(2))进行急性毒性试验研究。试验采用剂量递减法确定LB-ZnI_(2)对昆明小鼠的绝对致死剂量(LD_(100))和最大耐受剂量(LD_(0)),采用寇氏法设计动物分组方案及给药剂量,观察小鼠死亡情况、临床表现、重要脏器病理变化。结果显示,对昆明小鼠腹腔注射LB-ZnI_(2)的半数致死量(LD_(50))及其95%可信限分别为66.0 mg/kg·bw和53.8~80.9 mg/kg·bw。当药物剂量小于等于22 mg/kg·bw时,给药小鼠未出现死亡,且主要脏器形态、颜色和组织切片与正常对照组无显著差异;而当给药剂量大于33 mg/kg·bw时,小鼠开始出现死亡,死亡数量随着剂量增大而增加,且小鼠的肺脏出现淤血斑,脾脏出现萎缩,组织学观察发现脾脏中淋巴细胞坏死减少,脾小体萎缩,肺脏中肺泡上皮细胞脱落,肺间质增宽,大量炎性细胞浸润,同时充满大量红细胞,且这些变化与剂量呈正相关。研究表明,根据《兽药研究技术指导原则》(2006—2011年版)中化学物质的急性毒性剂量分级,可将LB-ZnI_(2)判定为中等毒化学物,在后续慢性毒性和药效学研究中的药物剂量应低于22 mg/kg·bw。

摘要：为制备猪肠病毒G型(EV-G)非结构蛋白3C的多克隆抗体,本研究参考EV-G分离株CH/17GXQZ/2017的序列设计带有酶切位点的引物扩增3C全基因,通过RT-PCR扩增,将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-EVG-3C。将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞中,通过对诱导条件(诱导温度、IPTG浓度以及诱导时间)的筛选,获得重组3C蛋白的最优表达条件。将表达纯化后的3C蛋白通过皮下注射的方式免疫新西兰大白兔,制备3C蛋白多克隆抗体,通过间接ELISA测定效价,并利用间接免疫荧光试验及Western-blot进行验证。结果显示,表达的3C蛋白主要以包涵体的形式存在,相对分子质量约为38.8 ku;经间接ELISA方法测定,制备的EV-G兔抗效价达到1∶8192000;间接免疫荧光试验和Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能与EV-G特异性结合,具有良好的免疫原性和反应性。本研究为EV-G的诊断以及3C蛋白的功能研究提供了参考。

摘要：【目的】克隆猪源异质性核糖核蛋白A1(hnRNPA1)基因编码区(CDS)序列并构建其真核表达载体,为探究猪源hnRNPA1蛋白结构及其生物学特性提供理论参考。【方法】利用总RNA提取试剂盒提取PK-15细胞总RNA并反转录合成cDNA,以此为模板,采用SnapeGene设计hnRNPA1基因特异性扩增引物,PCR扩增获得hnRNPA1基因CDS序列。通过ProtParam、ExPASy-ProtScale、TMHMM-1.0、SignalP-6.0、SPOMA、SWISS-MODEL和NetPhos 3.1等预测hnRNPA1蛋白的理化性质、结构及磷酸化位点。构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体并转染HEK-293T细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blottiing和免疫荧光染色试验检测hnRNPA1基因真核表达载体构建情况、hnRNPA1蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。生物信息学分析结果显示,hnRNPA1基因CDS序列全长963 bp,编码320个氨基酸残基,hnRNPA1蛋白分子量约为35 kD,理论等电点(pI)为9.27,脂肪系数为38.34,不稳定系数为43.87(大于40.00),蛋白结构相对不稳定,总平均亲水性指数(GRAVY)为-0.879,属于亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构由α-螺旋(16.56%)、无规则卷曲(72.50%)和延伸链(10.94%)组成,存在48个潜在的磷酸化位点。Western blotting检测结果显示,真核表达载体pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag转染HEK-293T细胞后能成功表达hnRNPA1蛋白。免疫荧光染色结果显示,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。【结论】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。猪源hnRNPA1蛋白为不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构主要为无规则卷曲。成功构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。

摘要：哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性引物,并从MRV-3中扩增S1基因,构建重组质粒p MD18-S1,经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品,经反应体系及反应条件优化后首次初步建立了检测MRV-3的SYBR Green I荧光定量PCR(q PCR)方法。将质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板经该q PCR扩增,建立标准曲线,结果显示,质粒标准品在1.3×10^(8)拷贝/μL~1.3×10^(3)拷贝/μL与各自的Ct值均呈良好的线性关系,斜率为-3.1706,R^(2)为0.9999,熔解曲线为单峰。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、水牛匈爱病毒(Buf Hu V)、牛冠状病毒(BCo V)、牛细小病毒(BPV)和MRV-3的基因组DNA/c DNA为模板,利用本研究建立的q PCR方法检测,评估该方法的特异性;将质粒标准品10倍倍比稀释至1.3×10^(2)拷贝/μL~1.3×10^(8)拷贝/μL后作为模板,分别利用本研究建立的q PCR和常规PCR检测,比较两种方法的检测结果,评估本研究建立q PCR方法的敏感性;以1.3×10^(3)拷贝/μL~1.3×10^(7)拷贝/μL 5个不同浓度的质粒标准品为模板,利用该方法分别进行批内和批间的重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法只能检测出MRV-3,其他相关病原的检测结果均为阴性;该q PCR对质粒标准品的检测限为1.3×10^(3)拷贝/μL,比常规PCR敏感性高10 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于或等于1.0%,表明该q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法检测220份牛粪便样品,结果显示MRV-3的检出率(3.64%,8/220)高于常规PCR的检出率(1.36%,3/220),两种检测方法的阳性符合率达100%,阴性符合率为97.75%,总符合率为97.78%。综上所述,本研究首次建立的检测MRV-3的SYBR Green I q PCR方法可以用于临床牛腹泻病原的检测,为MRV-3尤其是牛源MRV-3提供了一种快速灵敏的检测手段,也为MRV-3的后续研究奠定了基础。

摘要：基于大肠杆菌原核表达的G重组蛋白缺少糖基化修饰,诱导机体产生中和抗体的能力较弱。为制备G蛋白多克隆抗体,针对G蛋白抗原Ⅳ区第251位氨基酸的中和抗原表位,以日本RABV疫苗株RC-HL的G蛋白序列为模板,设计了含有17个氨基酸的多肽序列MQTSDETKWCPPDQLVN(G17),合成后偶联KLH蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠,采集血液分离血清获得抗G蛋白多克隆抗体。实验显示,制备的多克隆抗体效价在1∶500以上,在1∶200的稀释度下,可以对原核表达的G重组蛋白、真核表达的G重组蛋白进行Western Blot检测。基于狂犬病病毒G蛋白抗原位点Ⅳ区制备获得的抗G蛋白多克隆抗体具有反应性好及特异性强的特点,能够用于检测G重组蛋白,为进一步研究G蛋白功能、研发单抗和设计疫苗打下良好基础。