摘要：为了建立快速、敏感的聚合酶链式反应(PCR)诊断斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus的肠败血症技术,作者根据NCB I公布的鮰爱德华氏细菌序列,设计了一对特异性诊断引物CM3/CM4,对鮰爱德华氏细菌特异基因片段进行PCR扩增试验,PCR反应条件的优化以及不同检测材料的比较,同时测试了该方法的特异性和敏感性,并对广西4个市县临床样品进行了检测。结果表明:用该引物可以扩增到与预计大小相符的276 bp鮰爱德华氏菌特异性片段;PCR反应与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、迟缓爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;用该PCR法可以检测出病鱼脑、肝、肾及脾中的病原菌,检测的最低细菌数为12个,且病鱼内脏组织、菌落及菌液均可直接用于该PCR扩增;临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析和生化鉴定结果一致。因此,本试验中所建立的PCR检测方法在斑点叉尾鮰肠败血症的诊断和防治方面具有较好的应用前景。

摘要：根据基因库中鸡白细胞介素2基因序列设计一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡的外周血淋巴细胞RNA中扩增,均得到大小为470 bp的特异性片断。将10个品种鸡的RT-PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上,得到重组质粒,经PCR和EcorⅠ、SalⅠ双酶切等方法鉴定后,测定鸡白细胞介素2基因序列。序列分析结果表明:广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因都编码143个氨基酸的成熟蛋白,分子量约为16.3 ku,与哺乳动物和其他品种鸡核苷酸序列的同源性分别为24.8%-30.3%、98.8%-99.8%,氨基酸的同源性为14.6%-16.7%、96.5%-98.6%。

摘要：为建立鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测方法,设计3对特异性引物,第1对扩增沙门菌属特异性毒力基因invA 285bp片段,第2对引物扩增沙门菌鸡宿主特异性基因fliC 600bp片段,第3对引物扩增沙门菌质粒毒力基因spvR 507bp片段,经过对反应条件的优化,建立了检测鸡源致病性沙门菌的多重PCR方法。该方法可以特异扩增携带毒力质粒的致病性鸡沙门菌,而与大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌、痢疾志贺菌及普通变形杆菌均无交叉反应;对沙门菌菌液的检出下限为4.5×102 CFU/mL,对重组质粒标准品的检出下限为1.67×103拷贝/μL。应用所建立的方法对采集的223份临床疑似病料进行检测,结果检出invA基因阳性27份,占12.11%,其中invA+spvR基因阳性19份,占8.52%;invA+fliC基因阳性2份,占0.89%;invA+spvR+fliC基因阳性6份,占2.69%。表明所建立的多重PCR可用于鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测及流行病学调查。

摘要：根据猪瘟病毒(CSFV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列特点,设计3对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV以及美洲型、欧洲型PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪的其它常见病毒无交叉反应;对CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV3种重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。应用该方法对253份临床疑似样品进行检测,结果病原阳性106份,其中20份为CSFV阳性,86份为美洲型PRRSV阳性,11份为CSFV和美洲型PRRSV混合感染,未检测到欧洲型PRRSV。试验表明,研究建立的多重qRT-PCR方法可用于CSFV和PRRSV的快速鉴别检测及流行病学调查。

摘要：为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别检测方法,针对PEDV基因序列设计3对特异性引物。第1对引物扩增野毒株(经典株、变异株)和疫苗株ORF3基因198 bp和148 bp片段;第2对引物扩增经典株和疫苗株S基因429 bp片段;第3对引物扩增变异株S基因274 bp片段。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PEDV经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异地检测PEDV,而与猪的其他重要病原FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRo V、PCV2、PRV无交叉反应;对重组质粒标准品的检出下限为2.62×10~2copies/L;重复试验获得了均匀一致的结果。应用该方法检测336份临床病料,PEDV阳性的120份,其中变异株96份、疫苗株21份、变异株和疫苗株混合感染3份。结果表明,本研究所建立的多重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于PEDV经典株、变异株和疫苗株的快速鉴别检测和流行病学调查。

摘要：为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。

摘要：为探讨脑心肌炎病毒(EMCV)感染后IL-6、iNOS基因的表达水平,从分子水平深入研究EMCV的致病机制,分别针对小鼠IL-6、iNOS及管家基因β-actin的基因序列设计特异性引物和探针,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-6、iNOS和β-actin的TaqMan rea-ltime PCR检测方法。该方法线性关系好,IL-6、iNOS和β-actin标准曲线的相关系数均达到0.998;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×101拷贝/μL;特异性强,只有以总RNA反转录成的cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才检测到荧光信号;重复性好,组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感染小鼠的脑、心脏中IL-6、iNOS mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的TaqMan real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于小鼠IL-6、iNOS基因的检测及定量分析。

摘要：为建立奶牛附红细胞体和伊氏锥虫两种病原诊断方法并探索二者之间在奶牛感染中的关系,本研究针对两病原分别设计两对特异性引物,建立了奶牛附红细胞体和伊氏锥虫感染的二重PCR诊断方法,其扩增片段大小分别为415bp和237bp。敏感性试验和特异性试验表明,附红细胞体和伊氏锥虫的DNA的最低检测量为0.154pg和0.105pg;与猪肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫无交叉反应。35份临床血样检测结果为:奶牛附红细胞体阳性率22.89%,伊氏锥虫阳性率8.89%,其中共感染率为2.89%。临床试验表明,该方法可用于奶牛附红细胞体和伊氏锥虫的诊断,特别适用于早期诊断。

摘要：为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的快速RT-PCR检测方法,根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV变异毒株的RT-PCR方法。结果显示,建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分疫苗株CV777和PEDV变异毒株,仅能扩增出PEDV变异毒株826bp的目的片段,与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法能检测到的最低核酸质量为11.3pg。利用该方法对采集自广西部分地区的123份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV阳性率为67.5%,变异毒株占总PEDV毒株的86.7%(72/83)。结果表明,该RT-PCR鉴别诊断方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。

摘要：为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经优化引物浓度、退火温度等反应条件,初步建立了同时检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV的多重RT-PCR方法。利用该方法同时检测SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3等主要猪源病毒,结果显示该方法仅对SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV检测为阳性,其他均为阴性,特异性较强;SVA、O型、亚洲I型、A型FMDV重组质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的多重RT-PCR方法检测,结果显示同一反应体系中,4种重组质粒标准品的检出下限均为2.5×10^2拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,该方法重复性较好。利用本实验建立的方法对2019年采集自广西30份临床疑似样品进行检测,结果显示,SVA、O型FMDV的阳性检出率分别为16.67%和63.33%;未检出亚洲I型及A型FMDV;同时采用国家标准《口蹄疫诊断技术》(GB/T18935-2003)中RT-PCR方法以及文献报道的SVA套式RTPCR方法对FMDV、SVA检测,结果与本实验建立的多重RT-PCR方法检测结果的符合率为100%。本研究首次建立的多重RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为鉴别检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV提供了有效的技术方法。