摘要：本研究通过生物素与链霉素的强亲和性原理,采用生物素-磁珠吸附微卫星富集法筛选卵形鲳鲹的微卫星分子标记序列.从201个菌落中挑选出152个阳性克隆进行测序,成功测序137个,微卫星含量达到90.13%,共得到131个重复次数在6次以上的微卫星DNA序列,除生物素探针中使用的CA重复外,还得到TG、TC、GA、ATTT的重复序列.其中完美型85个,占64.9%;非完美型36个,占27.5%;混合型10个,占7.6%.利用PrimerPremier5.0设计引物90对,挑选其中的60对引物进行合成和PCR筛选,结果显示,35对引物可扩增出特异性条带.筛选的卵形鲳鲹微卫星分子标记具有多态性,可用于遗传多样性分析.

摘要：根据近源物种线粒体序列的同源比对,在COI基因上下游保守区域设计一对通用引物COF/COR。以卵形鲳鲹肌肉总DNA为模板,PCR扩增获得特异的DNA片段,经克隆、测序和比对证实该片段包含了卵形鲳鲹线粒体COI基因完整编码区1551bp。对5个个体分别测序后比对,发现卵形鲳鲹COI基因DNA序列在钦州湾种群个体间至少存在7个变异位点,使5个个体分别具有5种不同的单倍型。将卵形鲳鲹种内不同个体及鲹科其他物种的CO I核酸序列进行比较分析,根据比对结果构建鲳鲹科各物种的系统进化树,支持鲹科下设四个亚科(鲹亚科,鰤亚科,鲳鲹亚科,鰆鲹亚科)的分类系统。通过COI基因遗传距离计算发现,卵形鲳鲹种内不同地理种群个体间遗传距离为0.001～0.005,显著低于Hebert等所推荐的物种鉴定最小种间遗传距离2%,而鲹科不同物种间遗传距离大于0.044,与形态学分类一致,说明COI作为卵形鲳鲹DNA条形码应用是可行的。

摘要：为了筛选凡纳滨对虾微卫星序列,构建了一个cDNA文库,并进行454高通量测序。结果得到500 177条mRNA序列片段,通过拼接获得了20 225条unigene,从中鉴定得到588条微卫星序列,设计了557对微卫星引物。随机挑选其中20对微卫星引物进行PCR扩增,结果有18对引物扩增成功。研究结果大大丰富了凡纳滨对虾的基因组资料,增加了凡纳滨对虾可用的微卫星标记数量,对于凡纳滨对虾的种质资源鉴定、遗传学研究和分子标记选育有重要意义。

摘要：通过电子克隆所得基因序列设计引物,采用RT-PCR方法首次克隆得到长度为885 bp的凡纳滨对虾亲环素A（Cyclophilins A）CYPA基因cDNA序列,其开放阅读框为35~529 bp,可编码164个氨基酸.推算其分子量约为17.6×103,理论等电点为8.55.与其他物种的CYPA基因比对发现,该基因的氨基酸序列具有较高的保守性.基于氨基酸序列的聚类分析表明,凡纳滨对虾与斑节对虾的亲缘关系最近.荧光定量PCR的结果显示该基因在组织中广谱表达,在抗病组中,胃中的表达量最高,心脏中的表达量最低,差异约为2倍.而在感病组中,该基因在心脏中的表达量最高,肌肉中的表达量最低.利用ProtFun在线预测蛋白质的功能分类,表明CYPA基因可能是一免疫应答抑制因子,参与凡纳滨对虾免疫防御反应.

摘要：构建一个对虾WSSV VP281基因的siRNA筛选体系,获取有效siRNA,为进一步开展siRNA抗WSSV研究建立基础。根据已报道的VP281基因编码序列,设计并合成一对引物,扩增出带双酶切位点的VP281。对VP281和质粒pEGFP-C1分别酶切后进行连接,获取表达载体pEGFP-VP281。利用专业软件设计3对靶向VP281的siRNA(VP281-siRNA1﹑VP281-siRNA2﹑VP281-siRNA3),并合成siRNA,将3种siRNA分别与pEGFP-VP281共转染PK细胞。采用Western blot方法检测GFP-VP281融合蛋白的表达,半定量RT-PCR方法检验siRNA抑制VP281基因转录的效果。结果显示,pEGFP-VP281可在BHK细胞正常表达融合蛋白GFP-VP281。3对siRNA对GFP-VP281的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,siRNA2的干扰效果最为显著。构建针对WSSV-VP281基因的siRNA筛选体系,初步验证了该系统的有效性,为开展siRNA抗WSSV研究建立了基础。

摘要：为方便筛选VP28特异性siRNAs,通过构建真核表达载体pEGFP-VP28,然后将设计的siRNA与pEGFP-VP28共转染BHK细胞,并采用Western blotting检测GFP-VP28融合蛋白的表达情况以及半定量RT-PCR检验siRNA抑制VP28转录的效果,建立了体外RNA干扰法筛选系统。结果表明,pEGFP-VP28能在BHK细胞正常表达,设计的3对siRNA对VP28的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,其中siRNA2的干扰效果最为显著。研究结论为开展RNA干扰在对虾体内抑制WSSV的研究建立基础。

摘要：为研究凡纳滨对虾免疫调节因子Rab蛋白在对虾机体的免疫调节过程中的作用机理,克隆了凡纳滨对虾Rab6A基因,并对其在感染对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)对虾不同组织中的表达情况进行了研究。根据日本对虾Rab蛋白基因设计引物,采用RT-PCR方法克隆了长为558bp的Rab6A基因的部分cDNA序列,其开放阅读框为442bp,可编码147个氨基酸,推算其分子质量约为16.977ku,理论等电点为4.828,Rab6A与其他物种的Rab基因比对发现,该基因氨基酸序列具有较高的保守性。半定量PCR结果显示,Rab基因在不同组织中的表达情况没有明显的组织特异性,肝胰腺中表达量比其他组织略高,而在感染IHHNV的对虾心脏、肝胰腺、肠道、胃、腮、肌肉、血液组织中比正常组织中表达量增加,表明Rab蛋白参与抗病毒免疫反应。

摘要：VP15是南美白对虾WSSV病毒的一个核衣壳蛋白基因。采用体外干扰实验筛选对VP15具有针对性的siRNA。实验构建了真核表达载体pEGFP-VP15,并将设计的siRNA以及pEGFP-VP15共转染BHK细胞。采用Western blot方法检测GFP-VP15融合蛋白的表达,半定量RT-PCR方法检验siRNA抑制VP15基因转录的效果。实验结果表明,pEGFP-VP15在PK细胞正常表达,设计的3对siRNA对GFP-VP15的mRNA转录均有不同程度的干扰效果;其中,siRNA1的干扰效果最为显著。实验结果为下一步对虾体内干扰WSSV病毒复制研究以及筛选更多的特异siRNA建立基础。

摘要：通过电子克隆所得序列设计引物,采用RT-PCR方法首次克隆得到长655 bp的凡纳滨对虾通用转录因子3(Basic Tran-scription Factor 3,BTF3)基因序列,其中包括597 bp的完整开放阅读框,共编码198个氨基酸残基,推算分子量约45.79 kDa,理论等电点为4.93。氨基酸序列分析表明,BTF3基因编码的氨基酸序列中具有保守的NAC结构功能域,利用实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾不同组织的表达情况发现,该基因在凡纳滨对虾组织中广泛表达,其中肌肉组织表达量最高,在肠中表达量最低。

摘要：根据创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的溶细胞毒素基因序列和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的toxR基因序列,分别设计并合成两对特异性引物,通过PCR反应条件优化,测试两种菌的特异性和敏感性,建立双重PCR方法,同时快速检测***和***。结果表明:纯培养***和***的检测灵敏度分别是12 cfu/mL和18 cfu/mL,与无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌及美人发光杆菌无交叉反应;此PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性,具快速、高效等优点,对细菌***和***诊断与防治具有较好的临床应用性。