摘要：为进一步保护和开发中国本地水牛和国外引进水牛的遗传资源,建立快速区分鉴别本地和引进水牛品种的方法。设计57条随机扩增多态性(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)引物,对本地沼泽型水牛和国外引进的河流型(摩拉,尼里拉菲和地中海)水牛之间的遗传差异进行了调查。以128头水牛DNA样本为模板,通过PCR扩增从57条RAPD引物中筛选并优化反应条件。实验结果显示,筛选得到了5条可用于区分本地沼泽型水牛与引进河流型水牛的引物(OPG6,OPG7,S11,S40和S1013),建立了RAPD鉴别区分沼泽与河流水牛的方法。本实验的结果为中国水牛的杂交改良、良种培育和本地水牛种质资源的保护等工作提供了理论和实验依据。

摘要：【目的】克隆沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列,对启动子进行生物信息学分析及转录活性检测,为后续水牛繁殖性能的分子机理研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的河流型水牛(Bubalus bubalis)的VASA5′侧翼序列,经过同源比对,设计PCR引物。以沼泽型水牛血液基因组为模板扩增VASA基因5′侧翼序列并进行测序和生物信息学分析。将扩增的VASA基因5′侧翼片段插入pEGFP-1多克隆位点处,构建pVASA-EGFP-1载体。载体经脂质体转染HEK-293T和CHO细胞系,分析其转录活性。【结果】成功克隆沼泽型水牛VASA 5′侧翼序列及部分CDS区序列,共3 081bp,同源性分析表明,沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、小鼠和人的相似性分别为99%,96%,93%,95%,90%和79%。对其5′侧翼序列2 000bp进行启动子预测及转录因子结合位点预测,发现在其翻译起始位点上游-635--586处存在TATA box,启动子区存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子结合位点,其中Stat家族基因在VASA启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个Stats基因结合的情况。水牛VASA启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞中的表达,但非常微弱;能启动EGFP在CHO细胞中表达,且启动活性与CMV启动子相似。【结论】成功克隆了沼泽型水牛VASA基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性和转录活性。

摘要：锌指核酸酶是一种人工合成的融合蛋白,由特异性识别靶DNA的锌指蛋白结构域连接非特异性的Fok I切割结构域构造而成,能够在预定的DNA靶位点引起DNA双链中断,随后依靠非同源末端连接和同源重组修复两种途径修饰该位点。近些年来,该技术已广泛的应用于基因转变、基因修饰和基因治疗等方面的研究。本文将简要介绍锌指核酸酶结构与原理,重点对锌指核酸酶的设计和应用进行了回顾与展望。

摘要：为探讨水牛可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)基因功能,以水牛卵巢组织RNA转录的cDNA为模板,参考GenBank预测的水牛CART基因组序列设计引物,采用PCR和在线生信分析软件对CART基因进行克隆和蛋白质结构预测分析。结果显示:水牛CART基因CDS区全序列长为351 bp,编码116个氨基酸;对所得核酸序列和蛋白质结构分析预测显示,水牛CART基因与美洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼、单峰驼、野猪、马、非洲野驴、人类及猕猴相似程度分别为100%、98%、100%、98%、91%、91%、78%、85%、85%、81%、90%;Mega分析显示在多胃反刍动物间有较高同源性;蛋白质结构预测显示,CART蛋白含有N端信号肽,是分泌蛋白,功能与神经、辅酶和离子结合相关。

摘要：为了对广西本地水牛新生儿卵巢同源盒基因(NOBOX基因)5'侧翼序列进行克隆、生物信息学分析及其转录活性进行研究,试验采用Gen Bank上已公布的黄牛NOBOX基因5'侧翼序列设计引物,以广西本地水牛血液基因组为模板扩增NOBOX基因5'侧翼序列并进行生物信息学分析。结果表明:研究成功克隆得到广西本地沼泽型水牛NOBOX基因5'侧翼序列及部分CDS区序列,共2 906 bp。同源性分析结果表明,其与地中海水牛、黄牛、绵羊和山羊的相似性分别为99%、96%、91%、91%。试验对NOBOX基因5'侧翼序列2 000 bp进行启动子及转录因子结合位点预测,在其翻译起始位点上游-868/-853 bp处存在TATA box,启动子区存在GATAs、Foxo1、Foxo3、Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、YY1等反式作用元件结合位点,其中GATAs家族基因在NOBOX启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个GATA基因结合。水牛NOBOX启动子能够启动EGFP在HEK-293T细胞上表达,但表达非常微弱,也能够启动EGFP在CHO细胞上表达,且与CMV启动EGFP在CHO细胞中的表达强度相似,表明水牛NOBOX是个强启动子。

摘要：试验旨在对广西本地水牛FSHR基因5′侧翼序列进行克隆、生物信息学分析及其转录活性检测。根据GenBank已公布的黄牛FSHR 5′侧翼序列,本试验设计引物,以广西本地水牛血液基因组为模板扩增FSHR基因5′侧翼序列并进行生物信息学分析。结果显示本试验成功克隆了广西本地沼泽型水牛FSHR 5′侧翼序列及部分CDS区序列,共2 979bp,同源性比对分析结果表明其与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、猪和人的同源性分别为100%、99%、93%、92%、91%和75%。对其5′侧翼2 000bp序列进行启动子预测及转录因子结合位点预测,结果显示在其翻译起始位点上游-147bp附近存在TATA box,启动子区存在GATAs、FOXO1、FOXO3、Nobox、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6和YY1等反式作用元件结合位点,其中GATAs家族基因在FSHR启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个GATAs家族基因结合的情况。水牛FSHR启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞系中的表达,但表达非常微弱;也能启动EGFP在CHO细胞系中表达,且与CMV启动EGFP在CHO细胞系中的强度相似,结果表明水牛FSHR是个强启动子。总之,本研究成功克隆了沼泽型水牛FSHR基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性的转录活性,为后期水牛繁殖性能分子机理阐明及基于卵巢特异性表达外源基因的转基因水牛奠定了基础。

摘要：17β-雌二醇脱氢酶Ⅳ（17β-Hydroxysteroid dehydrogenaseⅣ,HSD17B4）是一种在类固醇代谢过程中发挥重要作用的酶蛋白。为了阐明HSD17B4基因对水牛繁殖性能的影响,试验以奶牛HSD17B4基因序列（登录号：NM_001007809.2）为探针设计引物,利用PT-PCR克隆水牛HSD17B4基因,并对基因的核苷酸序列和蛋白质序列特征进行生物信息学分析。结果显示,水牛HSD17B4基因mRNA序列全长2 680 bp,其中5＇端长145 bp,3＇端长324 bp,CDS序列长2 211 bp,编码736个氨基酸。同源序列分析显示,水牛HSD17B4基因编码序列与其他物种具有较高的同源性,证明成功克隆水牛HSD17B4,为进一步阐明该基因在水牛上的作用机制奠定基础。

摘要：本研究根据普通牛的κ-酪蛋白基因设计一对引物,首次成功扩增出了水牛的κ-酪蛋白外显子4基因,并经序列分析,结果表明κ-酪蛋白外显子4基因片段长780 bp。利用GenBank上的Blast进行比较,中国水牛κ-酪蛋白外显子4序列与地中海水牛、牛、牦牛的κ-酪蛋白外显子4序列同源性分别为99.5%、96.4%、95.9%;氨基酸同源性比较,中国水牛、地中海水牛、牛、牦牛均编码260个氨基酸,中国水牛与地中海水牛、牛、牦牛同源性分别为98.9%、92.0%和91.2%。核苷酸和氨基酸序列同源性结果显示,中国水牛和地中海水牛κ-酪蛋白基因变异不大。但由于在碱基230 bp处发生了一个碱基(A→C)的变化,从而导致其氨基酸也发生了变化,即K(Lys赖氨酸)→R(Arg精氨酸)。本研究为进一步对该基因的功能奠定基础。

摘要：本试验旨在研究饲粮粗蛋白质水平对泌乳水牛产奶量及氮代谢的影响。试验采用4×4拉丁方试验设计,选用16头体况良好、上期泌乳量相近、产犊胎次2～3胎、健康的泌乳前期水牛,随机分为4组,进行动物饲养试验和消化代谢试验。将4组泌乳水牛随机分配到4个梯度的饲粮粗蛋白质水平组,即16.0%、15.2%、14.4%、13.6%4个组,每组4头,进行4期饲养试验,每期21 d,共84 d。按照4×4拉丁方设计给各期各组泌乳水牛饲喂不同粗蛋白质水平的饲粮,每期试验预试期7 d。在第2期和第4期饲养试验的最后4 d开展2期氮消化代谢试验。结果表明,总采食氮、可消化氮、乳氮/进食氮以及氮表观消化率在部分组间差异显著(P0.05)。饲喂不同粗蛋白质水平饲粮对水牛产奶量、乳蛋白率、乳脂率、乳非脂固形物率和乳糖率均无显著影响(P>0.05)。血清总蛋白和尿素氮含量各组间差异不显著(P>0.05)。以试验期间进食氮水平(g/d)为横坐标(x),标准乳产量(kg/d)为纵坐标(y),获得进食氮水平与标准乳产量的二次曲线关系,即y=-0.001 6x2+0.955 6x-129.91。由此可见,饲粮粗蛋白质水平对泌乳水牛生产性能及血液生化指标影响不显著,根据进食氮水平与标准乳产量的二次曲线关系可得,当进食氮水平为298.625 g/d时,得到水牛标准乳产量最大值为12.773 kg/d。

摘要：本研究旨在通过试验手段研究生长母水牛能量需要量。试验选用12头体况良好，12～13月龄，体重相近[（209±20）kg]的健康生长母水牛，按随机区组的试验设计分为3组进行能量平衡试验，通过测定能量摄入量、消化率、产热量等研究其能量需要。3组试验日粮均由精料和粗料（象草和发酵菠萝皮）组成。3组精料粗蛋白质水平一致（17．5％），能量水平不同，产奶净能分别为6．71、6．40和6．07MJ／kg。饲养试验包括15d预试期和30d正试期，在正试期第24和28天分别进行为期7d的消化代谢试验和3d的气体代谢试验。试验结果表明，本研究条件下，12-13月龄生长母水牛正常采食状态下产热量（HP）为0．551MJ／（W^0.75·d），能量消化率为66．49％，能量代谢率为50．34％。生长母水牛用于维持的净能需要量为0．401MU／（W^0.75·d），每增重1kg所需要的净能为19．00MJ。12～13月龄生长母水牛净能总需要量可以按以下公式计算：NE（MJ／d）=（0．401＋0．319△W）W^0.75或NE（MJ／d）=0．401W^0.75＋19．00△W，式中△W为牛只日增重（kg／d）。