摘要：为建立一种快捷、灵敏的牛新孢子虫病检测方法,根据GenBank上登录的新孢子虫NcSAG1基因(AF132217)序列设计合成了2对环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立了检测牛新孢子虫病的LAMP技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。结果显示,LAMP方法扩增牛新孢子虫的电泳产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光,酶切鉴定出现目的条带,LAMP方法检测的敏感性为5×105copies/μL;特异性试验显示,新孢子虫检测管显色后呈阳性,而瑟氏泰勒虫、弓形虫和附红细胞体等对照组均呈阴性。表明,本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛新孢子虫病的检测。

摘要：根据猪附红细胞体OxaA膜蛋白基因设计了1对分别标记生物素和地高辛的引物,将PCR扩增产物固定至链霉亲和素包被的酶标板中进行酶联显色检测,并优化PCR扩增及ELISA检测步骤,建立了猪附红细胞体PCR-ELISA。结果显示,该方法较传统的PCR-ELISA节约近2h,最低能检出0.36pg的猪附红细胞体DNA,敏感性比常规PCR高10倍,且与猪链球菌、猪肺炎霉形体、大肠杆菌等无交叉反应。用该方法对64份猪血液中提取的DNA样品进行检测,结果阳性检出率为35.9%,明显高于常规PCR的28.1%。结果表明,建立的猪附红细胞体PCR-ELISA具有敏感、特异、安全和快速的特点。

摘要：为建立一种基于细菌16S r DNA的粪肠球菌PCR检测方法,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,通过死亡黑熊脏器中提纯的粪肠球菌测序结果与NCBI中的粪肠球菌16S r DNA序列(登录号:NZ_AJXO01000024.1)的比对,设计了1对特异性PCR引物,并对PCR反应条件、敏感性和特异性进行了测定。结果表明,扩增条带与预期的产物大小一致,经过测序结果分析,证明该条带为目的条带,其他种属的菌株未见条带;并且当引物工作剂量为0.2 L、酶工作剂量为0.15 L就可以扩增出清晰的目的条带,该方法的最小检出量为86 CFU;通过对13头份来自延边熊场的患病(4头)和健康(9头)黑熊粪便检测,患病样本检验结果均为PCR阳性,表明该特异性PCR诊断方法能简易、快捷地检测粪肠球菌,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供理论依据,同时也为黑熊疾病的防治奠定了临床基础。

摘要：根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫内转录间隔子基因(ITS基因)和牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列,设计合成了2对特异性引物。通过对反应条件进行优化,建立了同时检测牛瑟氏泰勒虫和牛卵形巴贝斯虫的多重PCR方法。结果显示,用该多重PCR方法可同时扩增出2条与试验设计相符的1 020bp(牛瑟氏泰勒虫)和537bp(牛卵形巴贝斯虫)的特异性条带,对牛瑟氏泰勒虫和牛卵形巴贝斯虫的最低检出限分别为10pg/μL和1pg/μL。用该方法对采自吉林省珲春市的23份临床样本进行检测,结果牛瑟氏泰勒虫的阳性率为69%,牛卵形巴贝斯虫的阳性率为52%,混合感染率为52%。表明,建立的多重PCR方法可用于临床诊断。

摘要：为建立一种能快速、特异、敏感地检测牛瑟氏泰勒虫的方法,根据GenBank中的牛瑟氏泰勒虫MPSP基因(GQ180198.1)设计合成了1对特异性引物,建立了检测牛瑟氏泰勒虫的二温式PCR方法。该方法与犬新孢子虫、猪支原体和弓形虫RH株均无交叉反应,能检测到的最低DNA含量为1.7pg/μL。结果表明,该二温式PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性。本研究为牛瑟氏泰勒虫的快速检测提供了一种方法。

摘要：为建立羊嗜血支原体(***)病快速检测方法,本实验根据GenBank中登录的羊*** 16S rRNA基因序列设计一对引物,以山羊和绵羊***基因组DNA为模板,建立*** PCR检测方法,并进行特异性、敏感性及临床应用试验。结果显示,建立的*** PCR检测方法扩增片段大小为508 bp,与GenBank中***参考株同源性达99%以上,该方法与猪嗜血支原体、牛嗜血支原体等病原体无交叉反应,最低检测40个拷贝的DNA;通过对延边地区60份山羊和绵羊血液样本的检测结果表明,建立的PCR检测方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于***的检测。

摘要：为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。

摘要：为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的免疫学特性,根据MAG1基因序列,设计并合成了1对用于扩增MAG1基因的引物。将PCR扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果显示,MAG1在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,表达蛋白的分子质量为65ku。Western-blot结果显示,表达的MAG1蛋白可被牛源犬新孢子虫阳性血清特异性识别,表明该MAG1蛋白具有较好的反应原性。本研究为新孢子虫病疫苗及诊断试剂盒的研究奠定了基础。

摘要：为了探究表位疫苗是否可以应用于预防牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti),根据MPSP(Majorpiroplasm surface protein)基因序列(FJ515689.1)设计合成了2对引物,以***基因组DNA为模板,通过SOE-PCR扩增出长约361 bp的双表位基因融合片段,2个表位基因通过linker(Gly4Ser)3相连。将该片段连接pGEX-4T-2,构建pGEX-4T-E1-2重组表达载体,转化BL2l,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳显示表达了约39 ku的融合蛋白。Western blot分析表明该双表位重组蛋白可与***阳性血清发生特异性反应,表明融合蛋白具有反应原性。

摘要：为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列(NC_015153.1),应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。