摘要：为了建立一种快速鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪圆环病毒4型(PCV-4)的方法,试验设计合成PCV-2、PCV-3、PCV-4特异性鉴别检测引物,经一步法三重RT-PCR反应条件的优化,建立了PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检测方法。该方法对PCV-2、PCV-3、PCV-4、PCV-2/PCV-3/PCV-4可分别扩增出216、415、678 bp、216 bp/415 bp/678 bp的特异性条带,检测PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV均为阴性,对PCV-2、PCV-3、PCV-4的最低检测量分别为1.0×102、1.0×10^(3)、1.0×10^(3)拷贝/μL,与PCV-2、PCV-3、PCV-4单项PCR方法的符合率均为100%,应用该方法检测85份临床病料样品,PCV-2、PCV-3、PCV-4阳性感染率分别为21.17%、14.12%、4.71%。说明建立的PCV-2、PCV-3、PCV-4三重PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、准确性和临床适用性,为PCV-2、PCV-3、PCV-4的临床鉴别诊断提供一种简便、快速的分子生物学检测技术。

摘要：为了建立一种快速检测猪流行性乙型脑炎病毒(Janpanese encephalitis virus,JEV)的病原学检测方法,并掌握达州市JEV的感染情况,试验根据GenBank中JEV E基因序列设计1对检测引物,建立一步法RT-PCR,并对退火温度(50,52,54,56,58℃)、模板添加量(1,2,4,6,8μL)、引物添加量(0.1,0.2,0.4,0.6,0.8μL)进行优化,考察方法的特异性、敏感性、重复性、符合性,同时对2017-2020年分别采集于达州市7个市(县、区)的243份样品进行JEV检测,对检测结果进行不同地区、不同年份、不同季节、不同饲养方式下猪群中JEV阳性率的比较分析。结果表明:优化后的一步法RT-PCR扩增体系为2×Step Buffer 12.5μL,上下游引物(20μmol/L)各0.4μL,RNA(68 ng/μL)4μL,H2O 7.7μL。扩增程序为50℃30 min;95℃5 min;94℃40 s,54℃40 s,72℃40 s,30个循环;72℃10 min;4℃终止反应。该方法能够特异性扩增JEV,而检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均为阴性,对JEV RNA的检测灵敏度为27.2 pg,对JEV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、PRV、PCV-2、PPV、3份JEV阳性病料、3份JEV阴性病料重复检测3次的结果完全一致,检测243份猪临床病料样品的平均阳性率为9.05%,其中不同地区阳性率为3.45%~13.04%,2017,2018,2019,2020年阳性率分别为5.77%、6.90%、10.29%和12.31%,夏季和冬季的阳性率分别为13.33%和5.17%,规模化养猪场和散养户的阳性率分别为5.94%和11.27%,说明建立的JEV一步法RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,达州市JEV的流行存在个别地区感染情况较严重、2019年和2020年感染情况较2017年和2018年严重、夏季感染情况较冬季严重、散养户感染情况较规模化养猪场严重等特点。

摘要：为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法,根据BVDV-1(AF091605.1、KF501393.1、MK204904.1、MN513404.1和MG923683.1)和BVDV-2(AF502399.1、MG436782.1、AF145969.1、KC176777.1和MN513411.1)流行毒株5′-UTR保守序列设计2对特异性引物,通过优化反应条件,建立可同时检测BVDV-1和BVDV-2的双重RT-PCR方法。结果显示,该检测方法重复性好、特异性强,可分别检测出BVDV-1和BVDV-2核酸,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;最低检测量为1×103拷贝/μL和1×102拷贝/μL;对达州及周边地区的332份临床样品进行检测,结果表明,该地区BVDV-1阳性率为7.83%,BVDV-2阳性率为0.90%,未检出BVDV-1和BVDV-2混合感染的临床样品。综上所述,建立的双重RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,可用于BVDV的临床诊断和分子流行病学调查。

摘要：目的原核表达猪圆环病毒2b亚型(porcine circovirus subtype 2b,PCV2b)Cap融合蛋白,并分析其免疫原性。方法以PCV2毒株(CAU0673)基因组为参考序列,His-Sumo-PCV2b-Cap-pUC57重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的片段;将其产物克隆至pMAL-C4x载体中,构建pC4x-PCV2b-Cap重组质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行直链淀粉树脂纯化。SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性,Western blot检测其反应原性;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,Western blot检测小鼠血清抗体特异性。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pC4x-PCV2b-Cap构建正确;融合蛋白MBP-Cap(matlose binding protein Cap)最适诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,其以可溶性形式存在,相对分子质量约为81000,与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBPtag多克隆抗体及免疫小鼠抗血清均可发生特异性反应。结论成功构建了pC4x-PCV2b-Cap重组表达载体,获得了可溶性的MBP-Cap蛋白,其纯化蛋白具有较好的免疫原性。本文为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。