摘要：目的:构建靶向乙肝病毒X基因(HBX)的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,并应用其体外抑制HBX促HepG2细胞凋亡的作用。方法:设计并构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3.1-HBX与pSilencer3.1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72小时后,分别以RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测HBX的表达量。Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪检测细胞的凋亡变化。结果:重组质粒pSilencer3.1-shHBX酶切鉴定和测序结果均与设计的一致。该质粒使HBX基因mRNA表达量降低了47.1%,进而使HBx蛋白表达量降低了58.9%,HBx蛋白荧光强度减弱,并使HBX诱导的HepG2细胞凋亡率降低了52.11%。而阴性对照质粒无此作用。结论:成功构建靶向HBXshRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,并可应用其抑制HBX促HepG2细胞凋亡的作用。

摘要：目的克隆、表达刚地弓形虫苹果酸脱氢酶(TgMDH)基因,并分析其免疫原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgMDH的基因编码序列(GenBank登录号为AY650028)设计引物,RT-PCR扩增产物双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化入大肠埃希菌(***)DH5α,经双酶切、PCR和测序鉴定阳性菌落。重组质粒pET30a(+)-TgMDH转化至*** BL21,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。优化表达条件,获得大量可溶性蛋白。经镍亲和层析法纯化后滴鼻免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗重组rTgMDH蛋白血清。分别以小鼠抗rTgMDH血清和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析rTgMDH蛋白的免疫原性。结果 TgMDH基因RT-PCR扩增产物约为951 bp。经双酶切、PCR和测序结果显示重组质粒pET30a(+)-TgMDH构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(M_r)约36 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析结果显示,rTgMDH蛋白能被该蛋白免疫的小鼠血清和兔抗弓形虫血清识别。结论本研究克隆的TgMDH基因序列能在原核表达系统中高效表达,且具有免疫原性。

摘要：目的应用RNA干扰技术沉默细胞内LASP-1蛋白的表达,探讨LASP-1蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖和迁移的作用。方法根据LASP-1 mRNA编码序列设计RNA干扰靶点并构建特异性小干扰RNA(siRNA),通过脂质体转染入HepG2细胞,采用Western blot法检测LASP-1蛋白的表达。采用CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell和划痕愈合实验方法,观察HepG2细胞增殖及迁移情况。结果 (1)LASP-1 siRNA对LASP-1蛋白表达水平有显著的下调作用(P<0.05)。(2)体外实验结果显示,与HepG2组及阴性对照组相比,siRNA组HepG2细胞增殖和克隆形成率明显被抑制(P<0.05),其迁移能力也下降(P<0.05)。结论下调LASP-1蛋白表达可显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移能力,提示LASP-1在肝癌细胞恶性增殖和转移过程中具有重要作用,为临床上寻找抑制肝癌增殖转移的靶点提供新的思路和方法。

摘要：目的：构建c－Jun特异性的shRNA及研究其抑制c－Jun蛋白表达对人类肝癌细胞HepG2增殖和迁移的影响。方法根据c－Jun编码序列设计并构建shRNA质粒，利用LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞，荧光显微镜观察转染效率。 Western blot检测其对c－Jun蛋白表达的影响。 CCK－8增殖实验、平板克隆形成实验观察HepG2细胞的增殖情况，transwell和划痕愈合实验方法观察细胞的迁移情况。结果构建了c－Jun小干扰质粒shRNA－1和shRNA－2。荧光显微镜观察到shRNA质粒在HepG2细胞转染效率约在80％。 Western blot显示shRNA－2小干扰质粒对c－Jun抑制效果要强于shRNA－1小干扰质粒。功能实验结果显示，与阴性对照组相比，shRNA－2能显著抑制HepG2细胞的增殖、克隆形成及其迁移能力（P均＜0．05）。结论成功构建了对c－Jun有效shRNA干扰质粒，下调c－Jun的表达能够明显抑制肝癌细胞的增殖和迁移，为进一步研究c－Jun在肝癌中的作用及相关机制提供了工作基础。

摘要：目的：克隆表达华支睾吸虫脂肪酸结合蛋白（ Clonorchis sinensisfatty acid binding protein，CsFABP），并对其免疫原性进行分析。方法根据编码CsFABP的已知基因序列设计合成一对引物，应用RT－PCR技术扩增编码CsFABP的基因片段。将扩增的CsFABP的基因片段克隆到原核质粒pET30a（＋）中，转化入大肠埃希菌（ E． coli） DH5α中，经含卡那霉素琼脂平板筛选，小量抽提质粒，经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。将阳性重组质粒转化入*** BL21中，经异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达，表达产物经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS－PAGE）、考马斯亮蓝染色、Western blot分析鉴定。结果经酶切、菌液PCR以及测序确认，成功构建重组质粒pET30a（＋）－CsFABP，并在*** BL21中高效表达。 Western blot试验证实表达的Cs-FABP能被特异的兔抗华支睾吸虫免疫血清识别。结论本研究成功构建重组质粒pET30a（＋）－CsFABP，获得的CsFABP表达蛋白质具有一定的反应原性。

摘要：目的:克隆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段(114～281氨基酸残基)并构建原核表达载体。方法:取健康人外周血提取总RNA,设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。结果:从外周血cDNA中扩增出501 bp的目的片段,测序结果证实成功构建重组质粒pGEX-6P-1/TRAIL。结论:成功构建TRAIL基因的原核表达载体pGEX-6P-1/TRAIL,为肿瘤细胞的凋亡研究提供理论依据。