摘要：目的克隆、表达刚地弓形虫苹果酸脱氢酶(TgMDH)基因,并分析其免疫原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgMDH的基因编码序列(GenBank登录号为AY650028)设计引物,RT-PCR扩增产物双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化入大肠埃希菌(***)DH5α,经双酶切、PCR和测序鉴定阳性菌落。重组质粒pET30a(+)-TgMDH转化至*** BL21,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。优化表达条件,获得大量可溶性蛋白。经镍亲和层析法纯化后滴鼻免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗重组rTgMDH蛋白血清。分别以小鼠抗rTgMDH血清和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析rTgMDH蛋白的免疫原性。结果 TgMDH基因RT-PCR扩增产物约为951 bp。经双酶切、PCR和测序结果显示重组质粒pET30a(+)-TgMDH构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(M_r)约36 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析结果显示,rTgMDH蛋白能被该蛋白免疫的小鼠血清和兔抗弓形虫血清识别。结论本研究克隆的TgMDH基因序列能在原核表达系统中高效表达,且具有免疫原性。

摘要：目的应用RNA干扰技术沉默细胞内LASP-1蛋白的表达,探讨LASP-1蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖和迁移的作用。方法根据LASP-1 mRNA编码序列设计RNA干扰靶点并构建特异性小干扰RNA(siRNA),通过脂质体转染入HepG2细胞,采用Western blot法检测LASP-1蛋白的表达。采用CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell和划痕愈合实验方法,观察HepG2细胞增殖及迁移情况。结果 (1)LASP-1 siRNA对LASP-1蛋白表达水平有显著的下调作用(P<0.05)。(2)体外实验结果显示,与HepG2组及阴性对照组相比,siRNA组HepG2细胞增殖和克隆形成率明显被抑制(P<0.05),其迁移能力也下降(P<0.05)。结论下调LASP-1蛋白表达可显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移能力,提示LASP-1在肝癌细胞恶性增殖和转移过程中具有重要作用,为临床上寻找抑制肝癌增殖转移的靶点提供新的思路和方法。